心血管疾病是全世界死亡的主要原因。血管钙化大大加重了心血管发病率和死亡率的负担。该协议描述了一种通过荧光成像在 体外 量化血管平滑肌细胞介导的钙沉淀的简单方法。
血管钙化涉及一系列退行性病变,包括炎症、细胞表型改变、细胞死亡和钙化抑制剂的缺乏,伴随导致血管弹性和功能丧失。血管钙化是许多疾病(包括慢性肾脏病、糖尿病和动脉粥样硬化)发病率和死亡率的重要因素。目前研究血管钙化的研究模型是有限的,仅在体内钙化发展的后期才可行。用于研究血管钙化的体外工具使用终点测量,增加了对生物材料的需求,并有可能将变异性引入研究。我们展示了一种新型荧光标记探针的应用,该探针与人体血管平滑肌细胞的体外钙化发展结合,并确定体外钙化的实时发展。在该协议中,我们描述了我们新开发的钙化测定的应用,这是一种具有潜在转化应用的疾病建模新工具。我们设想该测定法与更广泛的矿物沉积研究相关,包括骨骼、软骨或牙科研究的应用。
血管钙化 (VC) 是心血管疾病发病率和死亡率的独立危险因素1,2,3。长期以来被认为是异位矿物沉积的被动化学过程,现在它似乎是一种可改变的组织愈合反应,涉及各种细胞的积极贡献,包括活化的血管平滑肌细胞(hVSMC)作为疾病的驱动因素4,5。体内VC可以通过多层CT扫描来测量,作为动脉粥样硬化负荷的评估6,7,8。目前,范式转变正在进行中,其中VC严重程度被认为是心血管疾病,II型糖尿病,慢性肾病和衰老的危险因素9,10,11,12,13,14,15。
hVSMC是心血管系统中最丰富的细胞类型,也是VC发展的主要参与者。 体外 hVSMC诱导的钙化是研究心血管疾病的广泛使用的疾病模型16,17。然而,大多数用于体 外 钙化检测的方案使用终点测量,这可能会限制数据采集,需要更多地使用细胞材料,并且可能会减慢研究速度。检测 体外 hVSMC钙化的常用方法包括邻甲酚酞测定法,该测定法测量溶解钙沉积与总蛋白的关系,需要细胞裂解18。此外,使用茜素红染色,其直接与固定细胞或组织上的钙沉积物结合19。要研究邻甲酚酞或茜素红随时间推移的hVSMC钙化,每个时间点需要多次重复,这增加了对生物材料的需求,进而增加了变异性的机会。
在本文中,我们详细介绍了一种新型测定的应用方法,该测定利用hVSMC和荧光成像探针来确定 体外 VC进展,并用作单一终末期钙化测定。我们之前证明,该测定可与邻甲酚酞和茜素红方法直接相媲美,可用于区分不同的培养条件20。除了实时测量外,该测定还可用于确定血清或血浆样品作为临床VC开发的替代标志物的倾向20。这将有助于应用心血管科学和疾病建模的生物学策略。该测定的进一步应用可能是作为转化生物混合系统来评估VC的严重程度或血液成分(如血清或血浆)的进展。
在本手稿中,我们描述了一种用于 体外 钙化测定的半自动方法。对于这种方法,应优化hVSMC钙化的三个关键步骤。首先,细胞密度对于hVSMC钙化的发展至关重要。由于缺乏细胞间接触以及在钙化条件下诱导的应激,hVSMC的低密度将导致缓慢或无钙化和细胞死亡21。高细胞密度导致过度融合,之后细胞衰老22 ,钙化发育停止。在孔板中播种大约70%的汇合度至…
The authors have nothing to disclose.
这项研究由欧盟的地平线2020研究和创新计划资助,根据玛丽·斯克洛多夫斯卡-居里赠款协议第722609和764474,NWO ZonMw(MKMD 40-42600-98-13007)。这项研究得到了BioSPX的支持。WJ-D获得德国研究基金会TRR219项目ID 322900939和项目ID 403041552的资助
Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |