Eine halbautomatische und reproduzierbare biologisch basierte Methode zur Quantifizierung der Kalziumablagerung in vitro
Summary
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache. Gefäßverkalkungen tragen wesentlich zur Belastung durch kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität bei. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Quantifizierung der durch vaskuläre glatte Muskelzellen vermittelten Kalziumfällung in vitro durch fluoreszierende Bildgebung.
Abstract
Gefäßverkalkung beinhaltet eine Reihe von degenerativen Pathologien, einschließlich Entzündungen, Veränderungen des zellulären Phänotyps, Zelltod und das Fehlen von Verkalkungsinhibitoren, die gleichzeitig zu einem Verlust der Gefäßelastizität und -funktion führen. Gefäßverkalkung ist ein wichtiger Faktor für Morbidität und Mortalität in vielen Pathologien, einschließlich chronischer Nierenerkrankungen, Diabetes mellitus und Atherosklerose. Aktuelle Forschungsmodelle zur Untersuchung der Gefäßverkalkung sind begrenzt und nur in den späten Stadien der Verkalkungsentwicklung in vivo realisierbar. In-vitro-Werkzeuge zur Untersuchung von Gefäßverkalkungen verwenden Endpunktmessungen, was die Anforderungen an biologisches Material erhöht und die Einführung von Variabilität in Forschungsstudien riskiert. Wir demonstrieren die Anwendung einer neuartigen fluoreszenzmarkierten Sonde, die an die In-vitro-Verkalkungsentwicklung an menschliche vaskuläre glatte Muskelzellen bindet und die Echtzeitentwicklung der In-vitro-Verkalkung bestimmt. In diesem Protokoll beschreiben wir die Anwendung unseres neu entwickelten Verkalkungsassays, eines neuartigen Werkzeugs in der Krankheitsmodellierung, das potenzielle translationale Anwendungen hat. Wir gehen davon aus, dass dieser Assay in einem breiteren Spektrum der Mineralablagerungsforschung relevant ist, einschließlich Anwendungen in der Knochen-, Knorpel- oder Zahnforschung.
Introduction
Vaskuläre Verkalkung (VC) ist ein unabhängiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität 1,2,3. Lange Zeit als passiver chemischer Prozess der ektopischen Mineralablagerung betrachtet, erscheint es nun als modifizierbare Gewebeheilungsreaktion, die den aktiven Beitrag verschiedener Zellen einschließlich aktivierter vaskulärer glatter Muskelzellen (hVSMC) als Treiber der Krankheit beinhaltet 4,5. Im lebenden Organismus VC kann durch Multislice-CT-Scans als Beurteilung der atherosklerotischen Belastung gemessen werden 6,7,8. Derzeit ist ein Paradigmenwechsel im Gange, bei dem der Schweregrad von VC als Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-II-Diabetes, chronische Nierenerkrankungen und das Altern anerkannt wird 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMCs sind der häufigste Zelltyp im Herz-Kreislauf-System und ein Hauptakteur bei der Entwicklung von VC. In-vitro-hVSMC-induzierte Verkalkung ist ein weit verbreitetes Krankheitsmodell zur Untersuchung kardiovaskulärer Erkrankungen16,17. Die meisten Protokolle zum Nachweis von In-vitro-Verkalkung verwenden jedoch Endpunktmessungen, die die Datenerfassung einschränken, eine stärkere Verwendung von Zellmaterial erfordern und die Forschung verlangsamen können. Gängige Methoden zum Nachweis von in vitro hVSMC-Verkalkung umfassen den o-Cresolphthalein-Assay, der die solubilisierte Calciumablagerung gegen das Gesamtprotein misst und eine Zelllyse erfordert18. Außerdem wird Alizarin-Rot-Färbung verwendet, die direkt an Kalziumablagerungen auf festen Zellen oder Gewebe bindet19. Um die hVSMC-Verkalkung im Laufe der Zeit mit o-Cresolphthalein oder Alizarinrot zu untersuchen, sind Chargen von Replikaten pro Zeitpunkt erforderlich, was den Bedarf an biologischem Material erhöht und damit die Wahrscheinlichkeit einer Variabilität erhöht.
In diesem Artikel beschreiben wir die Methode für die Anwendung eines neuartigen Assays, der hVSMCs mit einer fluoreszierenden Bildgebungssonde verwendet, um die In-vitro-VC-Progression zu bestimmen und als singulärer Verkalkungsassay im Endstadium zu fungieren. Wir haben bereits gezeigt, dass dieser Assay direkt mit den o-Cresolphthalein- und Alizarin-Rot-Methoden vergleichbar ist und zur Unterscheidung zwischen unterschiedlichen Kulturbedingungen verwendet werden kann20. Zusätzlich zu Echtzeitmessungen kann dieser Assay verwendet werden, um die Neigung von Serum- oder Plasmaproben als Surrogatmarker für die klinische VC-Entwicklung zu bestimmen20. Dies wird bei der Anwendung biologischer Strategien der kardiovaskulären Wissenschaften und der Krankheitsmodellierung helfen. Eine weitere Anwendung des Assays kann als translationales BioHybrid-System zur Beurteilung des Schweregrads oder der Progression von VC aus Blutbestandteilen wie Serum oder Plasma erfolgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Manuskript beschreiben wir eine halbautomatische Methode zur in vitro Verkalkungsbestimmung. Für diese Methode sollten drei kritische Schritte der hVSMC-Verkalkung optimiert werden. Erstens ist die Zelldichte entscheidend für die Entwicklung der hVSMC-Verkalkung. Niedrige Dichten von hVSMCs führen zu langsamer oder keiner Verkalkung und Zelltod aufgrund des fehlenden Zell-zu-Zell-Kontakts und des Stresses, der unter kalzifizierenden Bedingungen induziert wird21. Hohe Zelldich…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch die Forschungs- und Innovationsprogramme Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie Sklodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 722609 und 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007), finanziert. Diese Forschung wurde von BioSPX unterstützt. WJ-D erhielt Förderung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR219-Projekt-ID 322900939 und Projekt-ID 403041552
Materials
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
Referências
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O’Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
