विट्रो में कैल्शियम जमाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक अर्ध-स्वचालित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जैविक-आधारित विधि
Summary
कार्डियोवैस्कुलर बीमारी दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण है। संवहनी कैल्सीफिकेशन कार्डियोवैस्कुलर रुग्णता और मृत्यु दर के बोझ में काफी योगदान देता है। यह प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा विट्रो में संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिका-मध्यस्थता कैल्शियम वर्षा को निर्धारित करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है।
Abstract
संवहनी कैल्सीफिकेशन में अपक्षयी विकृति की एक श्रृंखला शामिल है, जिसमें सूजन, सेलुलर फेनोटाइप में परिवर्तन, कोशिका मृत्यु और कैल्सीफिकेशन अवरोधकों की अनुपस्थिति शामिल है, जो सहवर्ती रूप से पोत लोच और कार्य के नुकसान का कारण बनती है। संवहनी कैल्सीफिकेशन क्रोनिक किडनी रोग, मधुमेह मेलेटस और एथेरोस्क्लेरोसिस सहित कई विकृतियों में रुग्णता और मृत्यु दर में एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता है। संवहनी कैल्सीफिकेशन का अध्ययन करने के लिए वर्तमान शोध मॉडल सीमित हैं और विवो में कैल्सीफिकेशन विकास के अंतिम चरणों में केवल व्यवहार्य हैं। संवहनी कैल्सीफिकेशन का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो उपकरण अंत-बिंदु माप का उपयोग करते हैं, जैविक सामग्री पर मांग बढ़ाते हैं और अनुसंधान अध्ययनों के लिए परिवर्तनशीलता की शुरूआत का जोखिम उठाते हैं। हम एक नए फ्लोरोसेंटली लेबल जांच के आवेदन का प्रदर्शन करते हैं जो मानव संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं पर इन विट्रो कैल्सीफिकेशन विकास को बांधता है और इन विट्रो कैल्सीफिकेशन के वास्तविक समय के विकास को निर्धारित करता है। इस प्रोटोकॉल में, हम अपने नए विकसित कैल्सीफिकेशन परख के आवेदन का वर्णन करते हैं, जो रोग मॉडलिंग में एक नया उपकरण है जिसमें संभावित ट्रांसलेशनल अनुप्रयोग हैं। हम इस परख को खनिज निक्षेपण अनुसंधान के व्यापक स्पेक्ट्रम में प्रासंगिक मानते हैं, जिसमें हड्डी, उपास्थि या दंत चिकित्सा अनुसंधान में अनुप्रयोग शामिल हैं।
Introduction
संवहनी कैल्सीफिकेशन (वीसी) कार्डियोवैस्कुलर रुग्णता और मृत्यु दर 1,2,3 के लिए एक स्वतंत्र जोखिम कारक है। लंबे समय से अस्थानिक खनिज जमाव की एक निष्क्रिय रासायनिक प्रक्रिया माना जाता है, अब यह एक परिवर्तनीय ऊतक उपचार प्रतिक्रिया दिखाई देता है जिसमें रोग 4,5 के चालक के रूप में सक्रिय संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (एचवीएसएमसी) सहित विभिन्न कोशिकाओं का सक्रिय योगदान शामिल है। विवो में वीसी को एथेरोस्क्लेरोटिक बोझ 6,7,8 के आकलन के रूप में मल्टीस्लाइस सीटी स्कैन द्वारा मापा जा सकता है। वर्तमान में, एक प्रतिमान बदलाव चल रहा है, जिसमें वीसी गंभीरता कार्डियोवैस्कुलर बीमारी, टाइप 2 मधुमेह, क्रोनिक किडनी रोग और 9,10,11,12,13,14,15 की उम्र में जोखिम कारक के रूप में मान्यता प्राप्त हो रही है।
एचवीएसएमसी कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम में सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार हैं और वीसी के विकास में एक प्रमुख अभिनेता हैं। इन विट्रो एचवीएसएमसी-प्रेरित कैल्सीफिकेशन कार्डियोवैस्कुलर बीमारी16,17 का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला रोग मॉडल है। हालांकि, इन विट्रो कैल्सीफिकेशन का पता लगाने के लिए अधिकांश प्रोटोकॉल अंत-बिंदु माप का उपयोग करते हैं जो डेटा अधिग्रहण को सीमित कर सकते हैं, सेलुलर सामग्री के अधिक उपयोग की आवश्यकता होती है, और अनुसंधान को धीमा कर सकते हैं। इन विट्रो एचवीएसएमसी कैल्सीफिकेशन का पता लगाने के लिए सामान्य तरीकों में ओ-क्रेसोल्थेलिन परख शामिल है, जो कुल प्रोटीन के खिलाफ घुलनशील कैल्शियम जमाव को मापता है और सेल लाइसिस18 की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, एलिज़ारिन लाल धुंधला का उपयोग किया जाता है, जो निश्चित कोशिकाओं या ऊतक19 पर कैल्शियम जमा को सीधे बांधता है। ओ-क्रेसोलफथेलिन या एलिजारिन रेड के साथ समय के साथ एचवीएसएमसी कैल्सीफिकेशन का अध्ययन करने के लिए प्रति समय बिंदु प्रतिकृति के बैचों की आवश्यकता होती है, जिससे जैविक सामग्री की मांग बढ़ जाती है, और बदले में, परिवर्तनशीलता की संभावना बढ़ जाती है।
इस पेपर में, हम एक नई परख के आवेदन के लिए विधि का विस्तार करते हैं जो इन विट्रो वीसी प्रगति को निर्धारित करने के साथ-साथ एक विलक्षण अंत-चरण कैल्सीफिकेशन परख के रूप में कार्य करने के लिए फ्लोरोसेंट इमेजिंग जांच के साथ एचवीएसएमसी का उपयोग करता है। हमने पहले प्रदर्शित किया था कि यह परख सीधे ओ-क्रेसोलफ्थेलिन और एलिज़रिन रेड विधियों के साथ तुलनीय है और इसका उपयोग अलग-अलग संस्कृति स्थितियों के बीच अंतर करने के लिए किया जा सकताहै। वास्तविक समय माप के अलावा, इस परख का उपयोग नैदानिक वीसी विकास20 के लिए सरोगेट मार्कर के रूप में सीरम या प्लाज्मा नमूनों की प्रवृत्ति निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यह कार्डियोवैस्कुलर विज्ञान और रोग मॉडलिंग की जैविक रणनीतियों के आवेदन में सहायता करेगा। परख का एक और अनुप्रयोग सीरम या प्लाज्मा जैसे रक्त घटकों से वीसी गंभीरता या प्रगति का आकलन करने के लिए एक ट्रांसलेशनल बायोहाइब्रिड सिस्टम के रूप में हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में, हम इन विट्रो कैल्सीफिकेशन निर्धारण के लिए एक अर्ध-स्वचालित विधि का वर्णन करते हैं। इस विधि के लिए, एचवीएसएमसी कैल्सीफिकेशन के तीन महत्वपूर्ण चरणों को अनुकूलित किया जाना चाहिए। स?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रमों द्वारा मैरी स्क्लोडोवस्का-क्यूरी अनुदान समझौते के तहत वित्त पोषित किया गया था, जो 722609 और 764474, एनडब्ल्यूओ ज़ोनएमडब्ल्यू (एमकेएमडी 40-42600-98-13007) है। इस शोध को BioSPX द्वारा समर्थित किया गया था। डब्ल्यूजे-डी को ड्यूश फोर्सचुंग्सगेमिनशाफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) टीआरआर 219-प्रोजेक्ट आईडी 322900939 और प्रोजेक्ट आईडी 403041552 से धन प्राप्त हुआ।
Materials
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
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