시험관 내에서 칼슘 침착을 정량화하기 위한 반자동화되고 재현 가능한 생물학적 기반 방법
Summary
심혈관 질환은 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다. 혈관 석회화는 심혈관 이환율 및 사망률의 부담에 실질적으로 기여합니다. 이 프로토콜은 형광 영상화에 의해 시험관내에서 혈관 평활근 세포 매개 칼슘 침전을 정량화하는 간단한 방법을 설명합니다.
Abstract
혈관 석회화는 염증, 세포 표현형의 변화, 세포 사멸 및 석회화 억제제의 부재를 포함한 일련의 퇴행성 병리를 수반하여 혈관 탄력 및 기능의 상실로 이어집니다. 혈관 석회화는 만성 신장 질환, 당뇨병 및 죽상 동맥 경화증을 포함한 많은 병리학에서 이환율과 사망률에 중요한 기여를합니다. 혈관 석회화를 연구하기 위한 현재의 연구 모델은 제한적이며 생체 내 석회화 발달의 후기 단계에서만 실행 가능합니다. 혈관 석회화를 연구하기 위한 시험관 내 도구는 종말점 측정을 사용하여 생물학적 물질에 대한 요구를 증가시키고 연구 연구에 가변성을 도입할 위험이 있습니다. 우리는 인간 혈관 평활근 세포에서 시험관 내 석회화 발달에 결합하고 시험관 내 석회화의 실시간 발달을 결정하는 새로운 형광 표지 프로브의 적용을 시연합니다. 이 프로토콜에서는 잠재적인 번역 응용 프로그램이 있는 질병 모델링의 새로운 도구인 새로 개발된 석회화 분석의 적용을 설명합니다. 우리는 이 분석이 뼈, 연골 또는 치과 연구의 응용을 포함하여 광범위한 광물 침착 연구와 관련이 있을 것으로 예상합니다.
Introduction
혈관 석회화 (VC)는 심혈관 이환율 및 사망률 1,2,3에 대한 독립적 인 위험 요소입니다. 오랫동안 이소성 광물 침착의 수동적 화학적 과정으로 간주되었던 이 반응은 이제 질병 4,5의 동인으로서 활성화된 혈관 평활근 세포(hVSMC)를 포함한 다양한 세포의 능동적 기여를 포함하는 수정 가능한 조직 치유 반응으로 나타납니다. 생체 내 VC는 죽상 경화성 부담 6,7,8의 평가로서 다중 슬라이스 CT 스캔으로 측정 할 수 있습니다. 현재, VC 중증도가 심혈관 질환, 제 2 형 당뇨병, 만성 신장 질환 및 노화 9,10,11,12,13,14,15의 위험 인자로 인식되고있는 패러다임 전환이 진행 중이다.
hVSMC는 심혈 관계에서 가장 풍부한 세포 유형이며 VC 개발의 주요 행위자입니다. 시험관내 hVSMC-유도 석회화는 심혈관 질환16,17을 연구하기 위해 널리 사용되는 질환 모델이다. 그러나 체외 석회화 검출을 위한 대부분의 프로토콜은 데이터 수집을 제한하고 세포 물질의 더 많은 사용을 요구하며 연구를 늦출 수 있는 종말점 측정을 사용합니다. 시험관 내 hVSMC 석회화의 검출을 위한 일반적인 방법에는 o-크레솔프탈레인 분석법이 포함되며, 이는 총 단백질에 대한 가용화된 칼슘 침착을 측정하고 세포 용해를 필요로 합니다18. 또한, 고정된 세포 또는 조직 상의 칼슘 침착물에 직접 결합하는 알리자린 레드 염색이 사용된다(19). o-크레솔프탈레인 또는 알리자린 레드를 사용하여 시간 경과에 따른 hVSMC 석회화를 연구하려면 시점당 반복실험 배치가 필요하므로 생물학적 물질에 대한 수요가 증가하고 결과적으로 변동성이 증가합니다.
이 백서에서는 hVSMC를 형광 이미징 프로브와 함께 사용하여 시험관 내 VC 진행을 결정하고 단일 말기 석회화 분석으로 기능하는 새로운 분석의 적용 방법을 자세히 설명합니다. 우리는 이전에 이 분석이 o-크레솔프탈레인 및 알리자린 레드 방법과 직접 비교할 수 있으며 다양한 배양 조건을 구별하는 데 사용할 수 있음을 입증했습니다20. 실시간 측정에 더하여, 이 분석은 임상 VC 발달(20)을 위한 대용 마커로서 혈청 또는 혈장 샘플의 성향을 결정하는데 사용될 수 있다. 이것은 심혈관 과학 및 질병 모델링의 생물학적 전략의 적용에 도움이 될 것입니다. 분석의 추가 적용은 혈청 또는 혈장과 같은 혈액 구성으로부터 VC 중증도 또는 진행을 평가하기 위한 번역 BioHybrid 시스템으로서 사용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고에서는 체외 석회화 측정을위한 반자동 방법을 설명합니다. 이 방법의 경우 hVSMC 석회화의 세 가지 중요한 단계를 최적화해야 합니다. 첫째, 세포 밀도는 hVSMC 석회화 발달에 중요합니다. hVSMC의 낮은 밀도는 석회화 조건21 하에서 유도되는 세포 간 접촉 및 스트레스의 부족으로 인해 석회화 및 세포 사멸이 느리거나 전혀 없을 것이다. 높은 세포 밀도는 과도한 합류?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 마리 스클로도프스카-퀴리 보조금 계약 722609 및 764474, NWO ZonMw(MKMD 40-42600-98-13007)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램의 자금 지원을 받았습니다. 이 연구는 BioSPX의 지원을 받았습니다. WJ-D는 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation)로부터 자금을 지원 받았다. TRR219-프로젝트 ID 322900939 및 프로젝트 ID 403041552
Materials
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
Referências
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