En semi-automatisert og reproduserbar biologisk-basert metode for å kvantifisere kalsiumavsetning in vitro

Summary

Hjerte- og karsykdommer er den ledende dødsårsaken over hele verden. Vaskulær forkalkning bidrar vesentlig til byrden av kardiovaskulær sykelighet og dødelighet. Denne protokollen beskriver en enkel metode for å kvantifisere vaskulær glatt muskelcellemediert kalsiumutfelling in vitro ved fluorescerende avbildning.

Abstract

Vaskulær forkalkning innebærer en rekke degenerative patologier, inkludert betennelse, endringer i cellulær fenotype, celledød og fravær av forkalkningshemmere, som samtidig fører til tap av fartøyets elastisitet og funksjon. Vaskulær forkalkning er en viktig bidragsyter til sykelighet og dødelighet i mange patologier, inkludert kronisk nyresykdom, diabetes mellitus og aterosklerose. Nåværende forskningsmodeller for å studere vaskulær forkalkning er begrenset og er bare levedyktige i de sene stadiene av forkalkningsutvikling in vivo. In vitro-verktøy for å studere vaskulær forkalkning bruker endepunktsmålinger, øker kravene til biologisk materiale og risikerer innføring av variabilitet i forskningsstudier. Vi demonstrerer anvendelsen av en ny fluorescerende merket sonde som binder seg til in vitro forkalkningsutvikling på humane vaskulære glatte muskelceller og bestemmer sanntidsutviklingen av in vitro forkalkning. I denne protokollen beskriver vi anvendelsen av vår nyutviklede forkalkningsanalyse, et nytt verktøy i sykdomsmodellering som har potensielle translasjonsapplikasjoner. Vi ser for oss at denne analysen er relevant i et bredere spekter av mineralavsetningsforskning, inkludert applikasjoner innen bein-, brusk- eller tannforskning.

Introduction

Vaskulær forkalkning (VC) er en uavhengig risikofaktor for kardiovaskulær sykelighet og dødelighet ^1,2,3. Lenge betraktet som en passiv kjemisk prosess med ektopisk mineralavsetning, ser det nå ut til å være en modifiserbar vevshelingsrespons som involverer det aktive bidraget fra forskjellige celler, inkludert aktiverte vaskulære glatte muskelceller (hVSMC) som en driver av sykdommen ^4,5. In vivo VC kan måles ved multislice CT-skanning som en vurdering av aterosklerotisk belastning ^6,7,8. For tiden pågår et paradigmeskifte, hvor VC-alvorlighetsgrad blir anerkjent som en risikofaktor for kardiovaskulær sykdom, type II diabetes, kronisk nyresykdom og aldring 9,10,11,12,13,14,15.

hVSMCs er den mest tallrike celletypen i kardiovaskulærsystemet og en hovedaktør i utviklingen av VC. In vitro hVSMC-indusert forkalkning er en mye brukt sykdomsmodell for å studere kardiovaskulær sykdom^16,17. Imidlertid bruker de fleste protokoller for påvisning av in vitro-forkalkning endepunktsmålinger som kan begrense datainnsamling, krever større bruk av cellulært materiale og kan bremse forskningen. Vanlige metoder for påvisning av in vitro hVSMC forkalkning inkluderer o-cresolphthalein analysen, som måler oppløselig kalsiumavsetning mot totalt protein og krever cellelyse¹⁸. Også Alizarin Red-farging brukes, som binder seg direkte til kalkavleiringer på faste celler eller vev¹⁹. For å studere hVSMC forkalkning over tid med enten o-cresolphthalein eller Alizarin Red krever batcher av replikasjoner per tidspunkt, øker etterspørselen på biologisk materiale, og i sin tur øker sjansen for variabilitet.

I dette papiret beskriver vi metoden for anvendelse av en ny analyse som bruker hVSMCs med en fluorescerende bildebehandlingssonde for å bestemme in vitro VC-progresjon, samt fungere som en enestående forkalkningsanalyse i sluttstadiet. Vi har tidligere vist at denne analysen er direkte sammenlignbar med o-cresolphthalein og Alizarin Red-metodene og kan brukes til å skille mellom varierende kulturforhold²⁰. I tillegg til sanntidsmålinger kan denne analysen brukes til å bestemme tilbøyeligheten til serum- eller plasmaprøver som en surrogatmarkør for klinisk VC-utvikling²⁰. Dette vil hjelpe til med anvendelsen av biologiske strategier for kardiovaskulær vitenskap og sykdomsmodellering. En ytterligere anvendelse av analysen kan være som et translasjonelt biohybridsystem for å vurdere VC-alvorlighetsgrad eller progresjon fra blodbestanddeler som serum eller plasma.

Protocol

1. Cellesåing, vedlikehold og forkalkningsinduksjon For dyrking av primære celler, bruk et laminært luftstrømskap, hansker og sterilt utstyr. Desinfiser hender og arbeidsområde før og etter å ha utført noe arbeid. Behandle alle primære celler og kulturmedier som en potensiell biohazard, med mindre det motsatte er bevist. Fortrinnsvis autoklavoverskuddsceller og medier før deponering. Ikke inaktiver og autoklav kjemisk, da dette vil frigjøre giftige røyk. Kultur hVSMC på u…

Representative Results

Resultatet inkluderer originale bilder av HOECHST-fargede kjerner, RFP-merket forkalkning og brightfield-bilder. Ulike stadier av forkalkning fra lav (figur 2) til høy (figur 3) kan oppdages og analyseres. Forkalkning kan vanligvis oppdages som svarte flekker ved hjelp av lysmikroskopi (figur 2D og figur 3B, pilene indikerer forkalkning), som er nyttige for primær vurdering og for å bestemme når man…

Discussion

I dette manuskriptet beskriver vi en halvautomatisert metode for bestemmelse av forkalkning in vitro . For denne metoden bør tre kritiske trinn for hVSMC-forkalkning optimaliseres. For det første er cellulær tetthet kritisk for hVSMC forkalkningsutvikling. Lav tetthet av hVSMCs vil resultere i langsom eller ingen forkalkning og celledød på grunn av mangel på celle-til-celle-kontakt og stresset som induseres under kalsifiseringsforhold²¹. Høye cellulære tettheter resulterer i overf…

Materials

Calcium chloride, 93%, anhydrous	Thermo Fisher Scientific	349615000
Costar 6-well Clear TC-treated well plates	Corning	3516
Cytation 3 System	BioTek, Abcoude, The Netherlands
Fetal Bovine Serum	Merck	F7524-100ML
Fetuin-A-Alexa Fluor-546	Prepared in-house
Gen5 Software v3.10	BioTek
Gibco Medium 199	Thermo Fisher Scientific	11150059
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H3570
PBS (10X), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300062