Um método semi-automatizado e reprodutível de base biológica para quantificar a deposição de cálcio in vitro

Summary

A doença cardiovascular é a principal causa de morte em todo o mundo. A calcificação vascular contribui substancialmente para a carga de morbidade e mortalidade cardiovascular. Este protocolo descreve um método simples para quantificar a precipitação de cálcio mediada por células musculares lisas vasculares in vitro por imagem fluorescente.

Abstract

A calcificação vascular envolve uma série de patologias degenerativas, incluindo inflamação, alterações no fenótipo celular, morte celular e ausência de inibidores da calcificação, que concomitantemente levam a uma perda de elasticidade e função dos vasos. A calcificação vascular é um importante contribuinte para a morbidade e mortalidade em muitas patologias, incluindo doença renal crônica, diabetes mellitus e aterosclerose. Os modelos de pesquisa atuais para estudar a calcificação vascular são limitados e só são viáveis nos estágios finais do desenvolvimento da calcificação in vivo. Ferramentas in vitro para o estudo da calcificação vascular utilizam medições de end-point, aumentando as demandas de material biológico e arriscando a introdução de variabilidade nos estudos de pesquisa. Demonstramos a aplicação de uma nova sonda marcada fluorescentemente que se liga ao desenvolvimento de calcificação in vitro em células musculares lisas vasculares humanas e determina o desenvolvimento em tempo real da calcificação in vitro . Neste protocolo, descrevemos a aplicação de nosso recém-desenvolvido ensaio de calcificação, uma nova ferramenta na modelagem de doenças que tem potenciais aplicações translacionais. Consideramos que este ensaio seja relevante em um espectro mais amplo de pesquisa de deposição mineral, incluindo aplicações em pesquisas ósseas, cartilaginosas ou odontológicas.

Introduction

A calcificação vascular (CV) é um fator de risco independente para morbidade e mortalidade cardiovascular ^1,2,3. Há muito considerado um processo químico passivo de deposição mineral ectópica, agora aparece uma resposta de cicatrização tecidual modificável envolvendo a contribuição ativa de várias células, incluindo células musculares lisas vasculares ativadas (hVSMC) como um impulsionador da doença ^4,5. In vivo A CV pode ser medida por tomografia computadorizada multislice como avaliaçã....

Protocol

1. Semeadura, manutenção e indução de calcificação celular

1. Para cultivar células primárias, use um gabinete de fluxo de ar laminar, luvas e equipamentos estéreis. Desinfete as mãos e o espaço de trabalho antes e depois de realizar qualquer trabalho. Trate todas as células primárias e meios de cultura como um potencial risco biológico, salvo prova em contrário. De preferência, células e meios excedentes de autoclave antes da eliminação. Não inative quimicamente e autoclave, pois isso liberará vapores tóxicos.
2. Cultura hVSMC em placas de cultura celular não revestidas.
3. Manter rotineiramente o hVSMC em meio de crescimento con....

Results

O resultado inclui imagens originais de núcleos corados com HOECHST, calcificação marcada com RFP e imagens de campo brilhante. Diferentes estágios de calcificação que variam de baixo (Figura 2) a alto (Figura 3) podem ser detectados e analisados. A calcificação geralmente pode ser detectada como manchas pretas usando microscopia de luz (Figura 2D e Figura 3B, setas indicam calcificação), que são úteis .......

Discussion

Neste manuscrito, descrevemos um método semi-automatizado para determinação da calcificação in vitro . Para este método, três etapas críticas da calcificação do hVSMC devem ser otimizadas. Primeiro, a densidade celular é crítica para o desenvolvimento da calcificação do hVSMC. Baixas densidades de hVSMCs resultarão em calcificação lenta ou nenhuma e morte celular devido à falta de contato célula-a-célula e ao estresse induzido sob condições calcificantes²¹. Altas densidades celulares resu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloreto de cálcio, 93%, anidro	Thermo Fisher Scientific	349615000
Costar 6-well Clear TC-treated well plates	Corning	3516
Cytation 3 System	BioTek, Abcoude, Holanda
Fetal Bovine Serum	Merck	F7524-100ML
Fetuin-A-Alexa Fluor-546	Preparado internamente
Software Gen5 v3.10	BioTek
Gibco Medium 199	Thermo Fisher Scientific	11150059
Hoechst 33342, Tricloridrato	Thermo Fisher Scientific	H3570
PBS (10X), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicilina-Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Thermo Fisher Scientific	25300062