Неразрушающая оценка плотности региональных клеток в опухолевых агрегатах после медикаментозного лечения
Summary
Настоящий протокол разрабатывает основанный на изображениях метод быстрого, неразрушающего и безметочного измерения плотности и жизнеспособности региональных клеток в 3D-опухолевых агрегатах. Результаты показали градиент плотности клеток с более высокой плотностью клеток в основных областях, чем во внешних слоях в развивающихся агрегатах, и преимущественно периферической гибелью клеток в агрегатах HER2+, обработанных Трастузумабом.
Abstract
Модели многоклеточных сфероидов опухолей (MCTS) продемонстрировали растущую полезность для изучения in vitro прогрессирования рака и открытия лекарств. Эти относительно простые аваскулярные конструкции имитируют ключевые аспекты опухолей in vivo , такие как 3D-структура и патофизиологические градиенты. Модели MCTSs могут дать представление о поведении раковых клеток во время развития сфероидов и в ответ на лекарства; однако их необходимый размер резко ограничивает инструменты, используемые для неразрушающей оценки. Структурная визуализация оптической когерентной томографии и программное обеспечение для 3D-анализа Imaris исследуются для быстрого, неразрушающего и безметочного измерения плотности региональных клеток в MCTS. Этот подход используется для оценки MCTS в течение 4-дневного периода созревания и в течение длительного 5-дневного лечения Трастузумабом, клинически значимым анти-HER2 препаратом. Вкратце, MCTS рака молочной железы AU565 HER2+ были созданы с помощью жидкого наложения с добавлением matrigel или без добавления Matrigel (базальная мембранная матрица) для изучения агрегатов различных морфологий (более толстые, дископодобные 2.5D агрегаты или плоские 2D-агрегаты, соответственно). Плотность клеток во внешней области, переходной области и внутреннем ядре характеризовалась в зрелых MCTS, выявляя градиент плотности клеток с более высокой плотностью клеток в основных областях по сравнению с внешними слоями. Добавление матрицы перераспределяло плотность клеток и усиливало этот градиент, уменьшая плотность внешней зоны и увеличивая уплотнение клеток в ядрах. Плотность клеток количественно определяли после лечения препаратом (0 ч, 24 ч, 5 дней) в прогрессивно более глубоких 100 мкм зонах для оценки потенциальных региональных различий в лекарственном ответе. К конечной временной точке почти вся гибель клеток, по-видимому, была ограничена внешними 200 мкм каждой совокупности, в то время как клетки, более глубокие в совокупности, оказались в значительной степени незатронутыми, что иллюстрирует региональные различия в ответе на лекарство, возможно, из-за ограничений в проникновении лекарств. Текущий протокол предоставляет уникальную технику для неразрушающей количественной оценки плотности региональных клеток в плотных клеточных тканях и измерения ее продольно.
Introduction
Исследователи в значительной степени обратились к настольным системам 3D-культур in vitro для изучения некоторых ключевых особенностей прогрессирования опухоли. Большая часть этих исследований была проведена повторным появлением многоклеточных сфероидов опухолей (MCTS) и более сложных органоидов 1,2. Хотя эти модели являются аваскулярными, они обеспечивают мощный инструмент для рекапитуляции физиологических и патологических процессов, которые происходят in vivo 3,4,5. В частности, модели среднего размера (диаметр 300-500 мкм) могут имитировать ключевые особенности опухоли, такие как 3D-структура, патофизиологические градиенты и метастатическая сигнализация из-за гипоксии в ядре. Хорошо задокументировано, что эти модели отображают характерные концентрические слои, наблюдаемые в васкуляризованных опухолях in vivo, а именно внешний слой пролиферативных клеток, переходный слой стареющих/покоящихся клеток и клетки, испытывающие гипоксию в ядре 3,6,7,8,9 . Уникальное понимание может быть получено из этих моделей, характеризуя поведение клеток в этих слоях, во время разработки и в ответ на препарат. Однако необходимый размер MCTS, необходимый для разработки градиентов, которые делают их такими мощными моделями in vitro, резко ограничивает инструменты, используемые для неразрушающей оценки. Действительно, одной из самых больших проблем с неразрушающим анализом MTCS является количественная оценка деталей клеточного масштаба. Ярко-полевая и фазово-контрастная микроскопия обычно используются для неразрушающей оценки роста и развития 3D-MCTS. Однако эти модальности ограничены 2D-проекциями, не имея возможности визуализировать важнейшую 3D-структуру этих моделей 10,11,12,13. Информация о цитотоксичности и пролиферации клеток обычно собирается с помощью флуоресцентной визуализации (т.е. микроскопии светового листа, конфокальной микроскопии) или иммуногистологического окрашивания ex vivo 14,15,16. Хотя эти подходы предоставляют ценную информацию с высоким разрешением о структуре ткани, клеточной плотности и клеточной функции, они часто требуют подготовки образцов, такой как оптическая очистка, фиксация / окрашивание или встраивание, которое предотвращает продольный анализ.
Оптическая когерентная томография (ОКТ) является неразрушающей структурной визуализацией, которая может преодолеть некоторые из проблем, упомянутых выше. Он может похвастаться сотовым разрешением и достаточно широким полем зрения (до 10 мм х 10 мм), способным визуализировать целые многоклеточные агрегаты 17,18,19. Важно отметить, что из-за видимого характера используемого света эта техника полностью неразрушающая и без меток17. Кроме того, образцы могут быть визуализированы in situ без необходимости пробоподготовки, так что образцы могут быть взяты прямо из инкубатора, быстро отсканированы с помощью OCT (продолжительность сканирования ~ 5-10 мин), а затем возвращены в инкубатор, что позволяет продольную характеристику. В последнее время появилось много исследований, направленных на использование ОКТ для анализа поведения сфероидов опухоли. В одной из самых захватывающих демонстраций Huang et al. использовали OCT для неразрушающего обнаружения некротических ядер в больших опухолевых сфероидных моделях, отметив, что области живых и мертвых клеток обладают заметными различиями в оптическом затухании, которые могут быть использованы для мониторинга жизнеспособности без меток20. Аналогичным образом, Hari et al. провели измерения показателя преломления (RI) сфероидов рака толстой кишки человека (HCT116), изображенных с помощью OCT, для изучения наличия гипоксии в образцах21. Их измерений было недостаточно для прямых выводов, хотя они наблюдали более низкий RI в местах, которые коррелировали с участком, хотя и не размером, некротических ядер, позже идентифицированных с помощью конфокальной микроскопии. Abd El-Sadek et al. использовали OCT для визуализации и количественной оценки региональной тканевой жизнеспособности моделей опухолей рака молочной железы22. Они сообщили о двух методах визуализации динамики тканей на основе OCT и показали умеренную корреляцию между различиями в этих показателях и идентифицированными микроскопией областями живых / мертвых клеток.
Наша опубликованная работа с использованием OCT основана на этой предыдущей литературе, чтобы установить количественный, неразрушающий подход к измерению морфологии 3D и количества клеток в моделях рака молочной железы MCTS во время разработки10,23. Используя программное обеспечение для анализа изображений Imaris 3D для подсчета количества объектов размером с клетку (т. Е. Пятен), изображенных в рамках сканирования объема OCT, количество клеток было неразрушающе измерено в MCTS, которые были статистически аналогичны тем, которые были определены с помощью гемоцитометра при совокупной диссоциации. Однако из-за структурной природы ОКТ клеточные мембраны, все еще присутствующие после гибели клеток в результате некроза, могут ошибочно считаться живыми клетками. Кроме того, эта характеристика была расширена для неразрушающего отслеживания жизнеспособности клеток в отдельных агрегатах, подвергшихся лекарственному режиму с многообещающим успехом10. Важно отметить, что аналогичная жизнеспособность клеток была сообщена из нашего подхода OCT-Imaris с тем, что было бенчмаркировано в этих образцах при диссоциации. Этот неразрушающий и безметочный подход к ячейкам позволяет подсчитывать ячейки в рамках 3D-конструкций и плотных агрегатов продольно без ущерба для конструкции / агрегатной структуры.
В настоящей работе сообщается об улучшенном подходе к непосредственной количественной оценке региональной плотности клеток в плотных агрегатах путем использования способности OCT-Imaris измерять как 3D-агрегированную морфологию, так и количество клеток. Это методологическое достижение обеспечивает более подробную картину пространственного распределения и пролиферации клеток в характерных концентрических слоях моделей MCTS. Вместо того, чтобы просто вычислять общую среднюю совокупную плотность клеток, такие локальные измерения плотности могут выявить градиенты плотности клеток, такие как те, которые связаны с уплотнением. Эта региональная оценка также применяется к агрегатам, получавшим химиотерапевтическое средство, для оценки регионального лекарственного ответа, измеряемого изменениями местной плотности клеток. Эта комбинация OCT и передовых методов анализа изображений обеспечивает количественную оценку жизнеспособности региональных клеток, которая может быть использована для изучения проникновения лекарств на основе того, какие области испытывают снижение плотности клеток. Это первый отчет, в котором неразрушающе количественно оценивается плотность и жизнеспособность региональных клеток в ответ на препарат в плотных клеточных тканях и измеряется его продольно. Такая характеристика трехмерной плотности клеток и пространственного распределения по всем MCTS может помочь оптимизировать доставку лекарств при лечении рака и улучшить понимание прогрессирования модели рака.
Protocol
Representative Results
Discussion
Значение
Многоклеточные сфероиды опухолей (MCTS) являются мощными 3D-моделями in vitro для изучения прогрессирования опухоли и скрининга лекарств 1,2,3. Продвижение полезности этих относительно простых агрегированных моделей …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) и NIH R01 CA233188 (MB). Мы хотели бы поблагодарить AMC Pharmacy за Трастузумаб, предоставленный для этих экспериментов.
Materials
| 96 well plates | Greiner Bio-One | 650970 | CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/ |
| 0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| AU565 breast cancer cells | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| FIJI software | open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267151B | |
| Imaris image analysis software | Bitplane | Current version 9.8 | |
| L-glutamine | Lonza | 17-605E | |
| Matrigel | Corning | 354263 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | ||
| Microscope | Zeiss | Z1 AxioVision | |
| Penicilin streptomycin | Corning | 30-0002CI | |
| Plate centrifuge | Eppendorf | ||
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| Spectral Domain Optical Coherence Tomography | ThorLabs | TEL220C1 | |
| T75 cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Trastuzumab | Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy. |
Referências
- Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).
- Freyei, J. P., Sutherland, R. M. Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply. Pesquisa do Câncer. 46 (7), 3504-3512 (1986).
- Desoize, B., Jardillier, J. C. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).
- Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs. British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).
- Roberge, C. L., et al. Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug. Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).
- Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).
- Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography HHS public access. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
- Zhong, H. Q., et al. Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography. Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).
- Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
- Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Pesquisa do Câncer. 77 (21), 6011-6020 (2017).
- Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- El-Sadek, I. A., et al. Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation. Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844 (2021).
- Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography. Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).
- Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment. Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).
- Noto, A., et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells. Cell Death & Disease. 4 (12), 947 (2013).
- Riffle, S., Hegde, R. S. Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102 (2017).
- Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).
- Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids. Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124 (2014).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Pozzi, S., et al. Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760 (2021).
- . High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening Available from: https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf (2015)
- Duchnowska, R., Szczylik, C. Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).
- Zazo, S., et al. Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines. American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).
