Valutazione non distruttiva della densità cellulare regionale all'interno degli aggregati tumorali dopo il trattamento farmacologico

Summary

Il presente protocollo sviluppa una tecnica basata su immagini per la misurazione rapida, non distruttiva e priva di etichette della densità cellulare regionale e della vitalità all’interno di aggregati tumorali 3D. I risultati hanno rivelato un gradiente di densità cellulare, con densità cellulari più elevate nelle regioni centrali rispetto agli strati esterni nello sviluppo di aggregati e morte cellulare prevalentemente periferica negli aggregati HER2+ trattati con Trastuzumab.

Abstract

I modelli di sferoidi tumorali multicellulari (MCTS) hanno dimostrato una crescente utilità per lo studio in vitro della progressione del cancro e della scoperta di farmaci. Questi costrutti avascolare relativamente semplici imitano aspetti chiave dei tumori in vivo , come la struttura 3D e i gradienti fisiopatologici. I modelli MCTS possono fornire informazioni sul comportamento delle cellule tumorali durante lo sviluppo di sferoidi e in risposta ai farmaci; tuttavia, le loro dimensioni richieste limitano drasticamente gli strumenti utilizzati per la valutazione non distruttiva. L’imaging strutturale della tomografia a coerenza ottica e il software di analisi 3D Imaris sono esplorati per la misurazione rapida, non distruttiva e senza etichette della densità cellulare regionale all’interno degli MCTS. Questo approccio viene utilizzato per valutare gli MCTS in un periodo di maturazione di 4 giorni e durante un trattamento prolungato di 5 giorni con Trastuzumab, un farmaco anti-HER2 clinicamente rilevante. In breve, gli MCTS per il cancro al seno AU565 HER2+ sono stati creati tramite sovrapposizione liquida con o senza l’aggiunta di Matrigel (una matrice di membrana basale) per esplorare aggregati di diverse morfologie (aggregati 2.5D più spessi, simili a dischi o aggregati 2D piatti, rispettivamente). La densità cellulare all’interno della regione esterna, della regione di transizione e del nucleo interno è stata caratterizzata in MCTS maturi, rivelando un gradiente di densità cellulare con densità cellulari più elevate nelle regioni centrali rispetto agli strati esterni. L’aggiunta della matrice ha ridistribuito la densità cellulare e migliorato questo gradiente, diminuendo la densità della zona esterna e aumentando la compattazione cellulare nei nuclei. La densità cellulare è stata quantificata dopo il trattamento farmacologico (0 h, 24 h, 5 giorni) all’interno di zone progressivamente più profonde di 100 μm per valutare le potenziali differenze regionali nella risposta al farmaco. Nel punto temporale finale, quasi tutta la morte cellulare sembrava essere vincolata ai 200 μm esterni di ciascun aggregato, mentre le cellule più profonde nell’aggregato apparivano in gran parte inalterate, illustrando le differenze regionali nella risposta al farmaco, probabilmente a causa di limitazioni nella penetrazione del farmaco. L’attuale protocollo fornisce una tecnica unica per quantificare in modo non distruttivo la densità cellulare regionale all’interno dei tessuti cellulari densi e misurarla longitudinalmente.

Introduction

I ricercatori si sono in gran parte rivolti a sistemi di coltura 3D da banco in vitro per studiare alcune delle caratteristiche chiave della progressione del tumore. Gran parte di questa ricerca è stata condotta dal riemergere di sferoidi tumorali multicellulari (MCTS) e organoidi più complessi ^1,2. Sebbene questi modelli siano avascolare, forniscono un potente strumento per ricapitolare i processi fisiologici e patologici che si verificano in vivo ^3,4,5. In particolare, i modelli di medie dimensioni (diametro 300-500 μm) possono imitare caratteristiche tumorali chiave come la struttura 3D, i gradienti fisiopatologici e la segnalazione metastatica dovuta all’ipossia all’interno del nucleo. È ben documentato che questi modelli mostrano i caratteristici strati concentrici osservati nei tumori vascolarizzati in vivo, vale a dire, uno strato esterno di cellule proliferative, uno strato transitorio di cellule senescenti / quiescenti e cellule che soffrono di ipossia nel nucleo 3,6,7,8,9 . Da questi modelli è possibile ottenere informazioni uniche caratterizzando il comportamento cellulare all’interno di questi strati, durante lo sviluppo e in risposta al farmaco. Tuttavia, la dimensione MCTS richiesta, necessaria per sviluppare i gradienti che li rendono modelli in vitro così potenti, limita drasticamente gli strumenti utilizzati per la valutazione non distruttiva. In effetti, una delle maggiori sfide con l’analisi non distruttiva degli MTCS è quantificare i dettagli della scala cellulare. La microscopia a campo luminoso e a contrasto di fase viene utilizzata abitualmente per valutare la crescita e lo sviluppo degli MCTS 3D in modo non distruttivo. Tuttavia, queste modalità sono limitate alle proiezioni 2D, mancando la capacità di visualizzare la struttura 3D cruciale di questi modelli 10,11,12,13. Le informazioni sulla citotossicità e sulla proliferazione cellulare sono tipicamente raccolte attraverso l’imaging fluorescente (cioè microscopia a foglio luminoso, microscopia confocale) o colorazione immunoistologica ex vivo 14,15,16. Mentre questi approcci forniscono preziose informazioni ad alta risoluzione sulla struttura del tessuto, la densità cellulare e la funzione cellulare, spesso richiedono la preparazione del campione come la compensazione ottica, il fissaggio / colorazione o l’incorporamento che impedisce le analisi longitudinali.

La tomografia a coerenza ottica (OCT) è una modalità di imaging strutturale non distruttiva che ha il potenziale per superare alcune delle sfide sopra menzionate. Vanta una risoluzione cellulare e un campo visivo sufficientemente ampio (fino a 10 mm x 10 mm) in grado di visualizzare interi aggregati multicellulari 17,18,19. È importante sottolineare che, a causa della natura visibile della luce utilizzata, questa tecnica è completamente non distruttiva e priva di etichette¹⁷. Inoltre, i campioni possono essere ripresi in situ senza richiedere la preparazione del campione, in modo tale che i campioni possano essere prelevati direttamente dall’incubatore, rapidamente scansionati con OCT (durata della scansione ~ 5-10 min), quindi restituiti all’incubatore, consentendo la caratterizzazione longitudinale. Molti studi che cercano di utilizzare OCT per analizzare il comportamento sferoide tumorale sono recentemente emersi. In una delle dimostrazioni più emozionanti, Huang et al. hanno utilizzato OCT per rilevare in modo non distruttivo nuclei necrotici all’interno di grandi modelli di sferoidi tumorali, osservando che le regioni delle cellule vive e morte possiedono differenze distinguibili nell’attenuazione ottica, che possono essere utilizzate per il monitoraggio della vitalità senza etichetta²⁰. Allo stesso modo, Hari et al. hanno condotto misurazioni dell’indice di rifrazione (RI) degli sferoidi del cancro del colon umano (HCT116) ripresi con OCT per studiare la presenza di ipossia all’interno dei campioni²¹. Le loro misurazioni non erano sufficienti per le inferenze dirette, anche se hanno osservato un RI inferiore in posizioni correlate con il sito, anche se non le dimensioni, dei nuclei necrotici, successivamente identificati tramite microscopia confocale. Abd El-Sadek et al. hanno utilizzato OCT per visualizzare e quantificare la vitalità tissutale regionale dei modelli tumorali del cancro al seno²². Hanno riportato due metodi basati su OCT per visualizzare le dinamiche dei tessuti e hanno mostrato una moderata correlazione tra le differenze in queste metriche e le regioni identificate al microscopio di cellule vive / morte.

Il nostro lavoro pubblicato utilizzando OCT si è basato su questa letteratura precedente per stabilire un approccio quantitativo e non distruttivo per misurare la morfologia 3D e il conteggio cellulare all’interno di modelli di cancro al seno MCTS durante lo sviluppo^10,23. Utilizzando il software di analisi delle immagini di rendering 3D Imaris per contare il numero di oggetti delle dimensioni di una cellula (cioè spot) ripresi all’interno delle scansioni del volume OCT, i conteggi delle cellule sono stati misurati in modo non distruttivo in MCTS che erano statisticamente simili a quelli determinati tramite emocitometro al momento della dissociazione aggregata. Tuttavia, a causa della natura strutturale dell’OCT, le membrane cellulari ancora presenti dopo la morte cellulare per necrosi possono essere erroneamente contate come cellule vive. Inoltre, questa caratterizzazione è stata estesa a monitorare in modo non distruttivo la vitalità cellulare all’interno di singoli aggregati sottoposti a un regime farmacologico con promettente successo¹⁰. È importante sottolineare che è stato notato che una simile vitalità cellulare è stata riportata dal nostro approccio OCT-Imaris con ciò che è stato confrontato all’interno di questi campioni al momento della dissociazione. Questo approccio cellulare non distruttivo e privo di etichette consente di contare le celle all’interno di costrutti 3D e aggregati densi longitudinalmente senza sacrificare la struttura di costruzione / aggregato.

Il presente lavoro riporta un approccio migliorato per quantificare direttamente la densità cellulare regionale all’interno di aggregati densi sfruttando la capacità di OCT-Imaris di misurare sia la morfologia aggregata 3D che il numero di cellule. Questo progresso metodologico fornisce un quadro più dettagliato della distribuzione spaziale e della proliferazione delle cellule all’interno dei caratteristici strati concentrici dei modelli MCTS. Piuttosto che calcolare semplicemente una densità di cella aggregata media complessiva, tali misurazioni della densità locale possono rivelare gradienti di densità cellulare, come quelli associati alla compattazione. Questa valutazione regionale viene applicata anche agli aggregati trattati con un chemioterapico per valutare la risposta al farmaco regionale, misurata dai cambiamenti nella densità cellulare locale. Questa combinazione di OCT e metodi avanzati di analisi di imaging fornisce la quantificazione della vitalità cellulare regionale, che può essere utilizzata per esplorare la penetrazione dei farmaci in base a quali regioni sperimentano diminuzioni della densità cellulare. Questo è il primo rapporto a quantificare in modo non distruttivo la densità e la vitalità delle cellule regionali in risposta al farmaco all’interno di tessuti cellulari densi e misurarlo longitudinalmente. Tale caratterizzazione della densità cellulare tridimensionale e della distribuzione spaziale attraverso interi MCTS può aiutare a ottimizzare la somministrazione di farmaci nel trattamento del cancro e migliorare la comprensione della progressione del modello di cancro.

Protocol

Per il presente studio sono state utilizzate linee cellulari di carcinoma mammario AU565 (HER2+) e MDA-MB-231 (vedere Tabella dei materiali). 1. Preparazione degli aggregati tumorali Preparare au565 (HER2+) mezzo di crescita cellulare del cancro al seno utilizzando il mezzo basale Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (+) in L-glutammina integrato con il 10% (v / v) di siero bovino fetale e l’1% di penicillina / streptomicina (vedi Tabe…

Representative Results

In una precedente pubblicazione, è stato stabilito un metodo per la misurazione non distruttiva della densità cellulare globale all’interno di aggregati cellulari utilizzando OCT10. Qui, questa tecnica viene estesa per valutare la densità cellulare regionale degli aggregati cellulari in via di sviluppo. La Figura 1 mostra uno schema di questa estensione, in cui la densità cellulare può essere valutata in strati concentrici di uno sferoide o più localmente osserv…

Discussion

Significato
Gli sferoidi tumorali multicellulari (MCTS) sono potenti modelli 3D in vitro per lo studio della progressione tumorale e lo screening farmacologico ^1,2,3. L’avanzamento dell’utilità di questi modelli aggregati relativamente semplici si basa fortemente sulla caratterizzazione delle loro caratteristiche chiave, come la morfologia e la densità cellulare, che sono note per influenzare sia l…

Materials

96 well plates	Greiner Bio-One	650970	CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
AU565 breast cancer cells	ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
FIJI software	open-source	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267151B
Imaris image analysis software	Bitplane		Current version 9.8
L-glutamine	Lonza	17-605E
Matrigel	Corning	354263
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC
Microscope	Zeiss	Z1 AxioVision
Penicilin streptomycin	Corning	30-0002CI
Plate centrifuge	Eppendorf
RPMI medium 1640	Gibco	11875-085
Spectral Domain Optical Coherence Tomography	ThorLabs	TEL220C1
T75 cell culture flasks	Greiner Bio-One	658175
Trastuzumab			Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy.