薬物治療後の腫瘍凝集体内の局所細胞密度の非破壊的評価
Summary
本プロトコルは、3D腫瘍凝集体内の迅速、非破壊的、かつラベルフリーの局所細胞密度および生存率測定のための画像ベースの技術を開発する。この知見は、細胞密度勾配を明らかにし、トラスツズマブで処理したHER2+凝集体では、凝集体の発生と主に末梢細胞死において、コア領域における細胞密度が外層よりも高いことを明らかにした。
Abstract
多細胞腫瘍スフェロイド(MCTS)モデルは、がんの進行に関する インビトロ 研究および創薬の有用性が高まっていることを実証している。これらの比較的単純な無血管構築物は、3D構造および病態生理学的勾配などの in vivo 腫瘍の重要な態様を模倣する。MCTSモデルは、スフェロイド発生中および薬物に対する応答における癌細胞の挙動に関する洞察を提供することができる。ただし、必要なサイズは、非破壊評価に使用されるツールを大幅に制限します。光コヒーレンス断層撮影構造イメージングとImaris 3D解析ソフトウェアは、MCTS内の局所細胞密度の迅速、非破壊、およびラベルフリー測定のために探求されています。このアプローチは、4日間の成熟期間にわたって、および臨床的に関連する抗HER2薬であるトラスツズマブによる5日間の延長治療を通してMCTSを評価するために利用される。簡単に説明すると、AU565 HER2+乳がんMCTSは、異なる形態の凝集体(それぞれ、より厚い、円盤状の2.5D凝集体または平らな2D凝集体)を探索するために、マトリゲル(基底膜マトリックス)の添加の有無にかかわらず、液体オーバーレイ を介して 作成された。外側領域、遷移領域、および内側コア内の細胞密度は、成熟したMCTSにおいて特徴付けられ、外層と比較してコア領域におけるより高い細胞密度を有する細胞密度勾配を明らかにした。マトリックスは、セル密度を再分配し、この勾配を強化し、外側ゾーン密度を減少させ、コア内のセル圧縮を増加させる。細胞密度を、薬物応答の潜在的な地域差を評価するために、漸進的に深い100μmゾーン内の薬物処理(0時間、24時間、5日)後に定量した。最終時点までに、ほとんどすべての細胞死は各凝集体の外側200μmに拘束されているように見えたが、凝集体内のより深い細胞はほとんど影響を受けていないように見え、おそらく薬物浸透の制限による薬物応答の局所的な違いを示した。現在のプロトコルは、高密度の細胞組織内の局所細胞密度を非破壊的に定量化し、それを縦方向に測定する独自の技術を提供します。
Introduction
研究者らは、腫瘍進行の重要な特徴のいくつかを研究するために、主にベンチトップ3D培養in vitroシステムに目を向けている。この研究の多くは、多細胞腫瘍スフェロイド(MCTS)およびより複雑なオルガノイド1,2の再出現によって導かれてきた。これらのモデルは水蒸気であるが、それらはインビボで起こる生理学的および病理学的プロセスを反復するための強力なツールを提供する3、4、5。特に、中規模モデル(直径300~500μm)は、3D構造、病態生理学的勾配、コア内の低酸素による転移性シグナル伝達などの主要な腫瘍特徴を模倣することができる。これらのモデルは、血管化されたin vivo腫瘍に見られる特徴的な同心円状の層、すなわち増殖性細胞の外層、老化/静止細胞の移行層、およびコア3,6,7,8,9において低酸素状態を経験している細胞を示すことが十分に文書化されている3,6,7,8,9 .これらのモデルから、これらの層内、開発中および薬物への応答における細胞挙動を特徴付けることによって、独自の洞察を得ることができます。しかし、インビトロモデルを非常に強力にする勾配を開発するために必要なMCTSサイズは、非破壊評価に使用されるツールを大幅に制限します。実際、MTCSの非破壊分析における最大の課題の1つは、細胞スケールの詳細を定量化することです。明視野顕微鏡および位相差顕微鏡は、3D MCTSの成長と発達を非破壊的に評価するために日常的に利用されています。しかし、これらのモダリティは2D投影に限定されており、これらのモデル10,11,12,13の重要な3D構造を視覚化する能力に欠けている。細胞毒性および細胞増殖に関する情報は、典型的には、蛍光画像化(すなわち、光シート顕微鏡、共焦点顕微鏡)またはエクスビボ免疫組織学的染色14、15、16を介して収集される。これらのアプローチは、組織構造、細胞密度、および細胞機能に関する貴重で高解像度の情報を提供しますが、多くの場合、縦方向の分析を妨げる光学的透明化、固定/染色、埋め込みなどのサンプル調製が必要です。
光コヒーレンス断層撮影(OCT)は、上記の課題のいくつかを克服する可能性を秘めた非破壊構造イメージングモダリティです。これは、セルラー解像度と十分に広い視野(最大10mm x 10mm)を誇り、多細胞集合体全体を視覚化することができます17、18、19。重要なことに、使用される光の目に見える性質のために、この技術は完全に非破壊的であり、ラベルフリーである17。また、サンプルをインキュベーターから直接採取し、OCT(スキャン時間〜5〜10分)で迅速にスキャンし、インキュベーターに戻すことができるため、サンプル調製を必要とせずにその場でサンプルを画像化することができ、縦方向の特性評価が可能になります。腫瘍スフェロイドの挙動を分析するためにOCTを使用しようとする多くの研究が最近出現した。最もエキサイティングなデモンストレーションの1つで、HuangらはOCTを使用して大型腫瘍スフェロイドモデル内の壊死コアを非破壊的に検出し、生細胞領域と死細胞領域には光減衰の識別可能な違いがあり、ラベルフリーの生存率モニタリングに利用できる可能性があると指摘しました20。同様に、Hariらは、試料21内の低酸素症の存在を研究するために、OCTで画像化したヒト結腸癌(HCT116)スフェロイドの屈折率(RI)測定を実施した。彼らの測定値は直接推論には十分ではなかったが、後に共焦点顕微鏡によって同定された壊死コアの部位(サイズではないが)と相関する場所でRIの低下を観察した。Abd El-SadekらはOCTを用いて、乳癌腫瘍モデルの局所組織生存率を可視化および定量化した22。彼らは、組織ダイナミクスを視覚化するための2つのOCTベースの方法を報告し、これらのメトリックの違いと顕微鏡検査で同定された生細胞/死細胞の領域との間に中程度の相関関係を示した。
OCTを用いた我々の出版された研究は、この先行文献に基づいて構築され、開発中のMCTS乳癌モデル内の3D形態および細胞数を測定するための定量的、非破壊的アプローチを確立した10,23。Imaris 3Dレンダリング画像解析ソフトウェアを使用して、OCTボリュームスキャン内で画像化された細胞サイズのオブジェクト(すなわち、スポット)の数をカウントし、凝集解離時に血球計数器を介して決定されたものと統計的に類似していたMCTSにおいて、細胞カウントを非破壊的に測定した。しかし、OCTの構造的性質上、壊死による細胞死後もなお存在する細胞膜は、誤って生細胞として数えられることがある。さらに、この特徴付けは、有望な成功を伴う薬物レジメンに付された個々の凝集体内の細胞生存率を非破壊的に追跡するために拡張された10。重要なことに、我々のOCT-Imarisアプローチから、解離時にこれらのサンプル内でベンチマークされたものと同様の細胞生存率が報告されたことに留意された。この非破壊的でラベルフリーの細胞アプローチにより、構築物/凝集体構造を犠牲にすることなく、3Dコンストラクトおよび高密度凝集体内で細胞を縦方向にカウントできます。
本研究は、OCT-Imarisの3D凝集体形態と細胞数の両方を測定する能力を活用することにより、高密度凝集体内の局所細胞密度を直接定量化する改善されたアプローチを報告している。この方法論の進歩は、MCTSモデルの特徴的な同心円層内の細胞の空間分布と増殖のより詳細な画像を提供する。このような局所密度測定は、単に凝集体全体の平均細胞密度を計算するのではなく、圧縮に関連するものなどの細胞密度勾配を明らかにすることができる。この局所的評価は、局所細胞密度の変化によって測定される局所的な薬物応答を評価するために、化学療法で処理された凝集体にも適用される。OCTと高度なイメージング解析方法のこの組み合わせは、細胞密度の低下を経験する領域に基づいて薬物浸透を探索するために使用することができる局所細胞生存率の定量化を提供する。これは、高密度の細胞組織内の薬物に応答して局所的な細胞密度および生存率を非破壊的に定量化し、それを縦方向に測定する最初の報告である。MCTS全体にわたる3次元細胞密度および空間分布のこのような特性評価は、がん治療における薬物送達を最適化し、がんモデルの進行の理解を改善するのに役立つ可能性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
意味
多細胞腫瘍スフェロイド(MCTS)は、腫瘍の進行および薬物スクリーニングを研究するための強力な3D in vitroモデルである1,2,3。これらの比較的単純な集合体の有用性を前進させることは、腫瘍モデルの進行および治療応答の両方に影響を与えることが知られている形態および細胞密度などのそれら?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) および NIH R01 CA233188 (MB) によって支持された。これらの実験に提供されたトラスツズマブについて、AMC薬局に感謝します。
Materials
| 96 well plates | Greiner Bio-One | 650970 | CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/ |
| 0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| AU565 breast cancer cells | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| FIJI software | open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267151B | |
| Imaris image analysis software | Bitplane | Current version 9.8 | |
| L-glutamine | Lonza | 17-605E | |
| Matrigel | Corning | 354263 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | ||
| Microscope | Zeiss | Z1 AxioVision | |
| Penicilin streptomycin | Corning | 30-0002CI | |
| Plate centrifuge | Eppendorf | ||
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| Spectral Domain Optical Coherence Tomography | ThorLabs | TEL220C1 | |
| T75 cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Trastuzumab | Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy. |
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