Ikke-destruktiv evaluering av regional celletetthet innen tumoraggregater etter medikamentell behandling

Summary

Den nåværende protokollen utvikler en bildebasert teknikk for rask, ikke-destruktiv og etikettfri regional celletetthet og levedyktighetsmåling innen 3D-tumoraggregater. Funn viste en celletetthetsgradient, med høyere celletetthet i kjerneregioner enn ytre lag i utviklingsaggregater og overveiende perifer celledød i HER2+ aggregater behandlet med trastuzumab.

Abstract

Multicellulære tumorsfæroidmodeller (MCTSer) har vist økende nytteverdi for in vitro-studier av kreftprogresjon og legemiddeloppdagelse. Disse relativt enkle avaskulære konstruksjonene etterligner viktige aspekter ved in vivo svulster, som 3D-struktur og patofysiologiske gradienter. MCTS-modeller kan gi innsikt i kreftcelleadferd under sfæroidutvikling og som respons på medisiner; Imidlertid begrenser deres nødvendige størrelse drastisk verktøyene som brukes til ikke-destruktiv vurdering. Optisk koherens Tomografi strukturell avbildning og Imaris 3D-analyseprogramvare utforskes for rask, ikke-destruktiv og etikettfri måling av regional celletetthet i MCTSer. Denne tilnærmingen brukes til å vurdere MCTSer over en 4-dagers modningsperiode og gjennom en utvidet 5-dagers behandling med Trastuzumab, et klinisk relevant anti-HER2-legemiddel. Kort fortalt ble AU565 HER2+ brystkreft MCTSer opprettet via væskeoverlegg med eller uten tilsetning av Matrigel (en kjellermembranmatrise) for å utforske aggregater av forskjellige morfologier (henholdsvis tykkere, disklignende 2.5D aggregater eller flate 2D aggregater). Celletetthet i ytre region, overgangsområde og indre kjerne ble karakterisert i modne MCTSer, og avslørte en celletetthetsgradient med høyere celletetthet i kjerneområder sammenlignet med ytre lag. Matrisetilsetningen omfordelte celletetthet og forbedret denne gradienten, reduserte ytre sonetetthet og økte cellekomprimeringen i kjernene. Celletetthet ble kvantifisert etter medikamentell behandling (0 timer, 24 timer, 5 dager) innen gradvis dypere 100 μm soner for å vurdere potensielle regionale forskjeller i legemiddelrespons. Ved det endelige tidspunktet syntes nesten all celledød å være begrenset til de ytre 200 μm av hvert aggregat, mens celler dypere i aggregatet virket stort sett upåvirket, noe som illustrerer regionale forskjeller i legemiddelresponsen, muligens på grunn av begrensninger i narkotikapenetrasjon. Den nåværende protokollen gir en unik teknikk for å ikke-destruktivt kvantifisere regional celletetthet i tette cellulære vev og måle den i lengderetningen.

Introduction

Forskere har i stor grad vendt seg til stasjonære 3D-kultur in vitro-systemer for å studere noen av de viktigste funksjonene i tumorprogresjon. Mye av denne forskningen har blitt ledet av gjenoppkomsten av multicellulære tumorsfæroider (MCTSer) og mer komplekse organoider ^1,2. Selv om disse modellene er avaskulære, gir de et kraftig verktøy for å rekapitulere fysiologiske og patologiske prosesser som forekommer in vivo ^3,4,5. Spesielt kan mellomstore modeller (300-500 μm diameter) etterligne viktige tumorfunksjoner som 3D-struktur, patofysiologiske gradienter og metastatisk signalering på grunn av hypoksi i kjernen. Det er godt dokumentert at disse modellene viser de karakteristiske konsentriske lagene som ses i vaskulariserte in vivo svulster, nemlig et ytre lag av proliferative celler, et overgangslag av senescent / hvilende celler og celler som opplever hypoksi i kjernen 3,6,7,8,9 . Unik innsikt kan oppnås fra disse modellene ved å karakterisere celleadferd i disse lagene, under utvikling og som respons på stoffet. Imidlertid begrenser den nødvendige MCTS-størrelsen, som er nødvendig for å utvikle gradientene som gjør dem til så kraftige in vitro-modeller, drastisk verktøyene som brukes til ikke-destruktiv vurdering. Faktisk er en av de største utfordringene med ikke-destruktiv analyse av MTCS-er kvantifisering av celleskaladetaljer. Lysfelt- og fasekontrastmikroskopi brukes rutinemessig for å vurdere 3D MCTSs vekst og utvikling ikke-destruktivt. Imidlertid er disse modalitetene begrenset til 2D-projeksjoner, og mangler kapasitet til å visualisere den avgjørende 3D-strukturen til disse modellene 10,11,12,13. Informasjon om cytotoksisitet og celleproliferasjon samles vanligvis inn ved fluorescerende avbildning (dvs. lysarkmikroskopi, konfokal mikroskopi) eller ex vivo immunohistologisk farging 14,15,16. Selv om disse tilnærmingene gir verdifull, høyoppløselig informasjon om vevsstruktur, cellulær tetthet og cellulær funksjon, krever de ofte prøvepreparering som optisk rydding, festing / farging eller innebygging som forhindrer langsgående analyser.

Optisk koherenstomografi (OCT) er en ikke-destruktiv strukturell bildebehandlingsmodalitet som har potensial til å overvinne noen av utfordringene nevnt ovenfor. Den har cellulær oppløsning og et tilstrekkelig bredt synsfelt (opptil 10 mm x 10 mm) som er i stand til å visualisere hele flercellede aggregater 17,18,19. Viktigere, på grunn av den synlige naturen til lyset som brukes, er denne teknikken helt ikke-destruktiv og etikettfri¹⁷. Prøver kan også avbildes in situ uten å kreve prøvepreparering, slik at prøver kan tas rett fra inkubatoren, raskt skannes med OCT (skanningsvarighet ~ 5-10 min), og deretter returneres til inkubatoren, noe som muliggjør langsgående karakterisering. Mange studier som søker å bruke OCT til å analysere tumorsfæroid oppførsel har nylig dukket opp. I en av de mest spennende demonstrasjonene brukte Huang og medarbeidere OCT til ikke-destruktivt å oppdage nekrotiske kjerner i store tumorsfæroidmodeller, og bemerket at levende og døde celleregioner har merkbare forskjeller i optisk demping, som kan brukes til etikettfri levedyktighetsovervåking²⁰. Tilsvarende gjennomførte Hari og medarbeidere brytningsindeksmålinger (RI) av human tykktarmskreft (HCT116) sfæroider avbildet med OCT for å studere tilstedeværelsen av hypoksi i prøvene²¹. Deres målinger var ikke tilstrekkelige for direkte slutninger, selv om de observerte lavere RI på steder som korrelerte med stedet, men ikke størrelsen, av nekrotiske kjerner, senere identifisert via konfokal mikroskopi. Abd El-Sadek og medarbeidere brukte OCT til å visualisere og kvantifisere regional vevs levedyktighet av brystkreftsvulstmodeller²². De rapporterte to OCT-baserte metoder for visualisering av vevsdynamikk og viste en moderat korrelasjon mellom forskjeller i disse beregningene og mikroskopi-identifiserte regioner av levende / døde celler.

Vårt publiserte arbeid ved hjelp av OCT bygget på denne tidligere litteraturen for å etablere en kvantitativ, ikke-destruktiv tilnærming for å måle 3D-morfologi og celletall i MCTSs brystkreftmodeller under utvikling^10,23. Ved å bruke Imaris 3D-gjengivelsesbildeanalyseprogramvare for å telle antall objekter i cellestørrelse (dvs. flekker) som ble avbildet i OCT-volumskanningene, ble celletellingene ikke-destruktivt målt i MCTSer som var statistisk lik de som ble bestemt via hemocytometer ved samlet dissosiasjon. På grunn av OCT’s strukturelle natur kan cellemembraner som fortsatt er tilstede etter celledød ved nekrose, feilaktig telles som levende celler. Videre ble denne karakteriseringen utvidet til ikke-destruktivt sporcelle levedyktighet innenfor individuelle aggregater utsatt for et legemiddelregime med lovende suksess¹⁰. Det ble bemerket at lignende celle levedyktighet ble rapportert fra vår OCT-Imaris-tilnærming med det som ble benchmarket i disse prøvene ved dissosiasjon. Denne ikke-destruktive og etikettfrie celletilnærmingen gjør det mulig å telle celler i 3D-konstruksjoner og tette aggregater i lengderetningen uten å ofre konstruksjons- / aggregatstrukturen.

Det nåværende arbeidet rapporterer en forbedret tilnærming til direkte kvantifisering av regional celletetthet i tette aggregater ved å utnytte OCT-Imaris evne til å måle både 3D-aggregatmorfologi og cellenummer. Denne metodologiske utviklingen gir et mer detaljert bilde av cellenes romlige fordeling og spredning innenfor de karakteristiske konsentriske lagene i MCTS-modeller. I stedet for bare å beregne en samlet gjennomsnittlig samlet celletetthet, kan slike lokale tetthetsmålinger avsløre celletetthetsgradienter, for eksempel de som er forbundet med komprimering. Denne regionale vurderingen brukes også på aggregater behandlet med kjemoterapeutisk for å vurdere regional legemiddelrespons, målt ved endringer i lokal celletetthet. Denne kombinasjonen av OCT og avanserte bildeanalysemetoder gir kvantifisering av regional celle levedyktighet, som kan brukes til å utforske stoffpenetrasjon basert på hvilke regioner som opplever reduksjoner i celletetthet. Dette er den første rapporten som ikke-destruktivt kvantifiserer regional celletetthet og levedyktighet som svar på stoffet i tette cellulære vev og måler det i lengderetningen. Slik karakterisering av tredimensjonal celletetthet og romlig fordeling gjennom hele MCTSer kan bidra til å optimalisere legemiddellevering i kreftbehandling og forbedre forståelsen av kreftmodellprogresjon.

Protocol

AU565 (HER2+) og MDA-MB-231 brystkreftcellelinjer ble brukt i denne studien (se materialtabell). 1. Forberedelse av tumoraggregater Forbered AU565 (HER2+) brystkreftcellevekstmedier ved bruk av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 basalt medium (+) i L-glutamin supplert med 10% (v / v) føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin (se materialtabell). Forbered MDA-MB-231 trippel-negativ brystkreftcellevekstmed…

Representative Results

I en tidligere publikasjon ble det etablert en metode for ikke-destruktiv måling av global celletetthet i celleaggregater ved bruk av OCT10. Heri er denne teknikken utvidet for å vurdere den regionale celletettheten til utviklende celleaggregater. Figur 1 viser et skjema av denne forlengelsen, hvor celletetthet kan evalueres i konsentriske lag av en sfæroid eller mer lokalt ved å se i stedet på små (100 μm diameter) sfæriske plugger, betegnet med de gule sirkl…

Discussion

Betydning
Multicellulære tumorsfæroider (MCTSer) er kraftige 3D in vitro-modeller for å studere tumorprogresjon og medikamentscreening ^1,2,3. Å fremme nytten av disse relativt enkle aggregatmodellene er avhengig av karakteriseringen av deres nøkkelegenskaper, som morfologi og celletetthet, som er kjent for å påvirke både tumormodellprogresjon og terapeutisk respons. Deres nødvendige størrel…

Materials

96 well plates	Greiner Bio-One	650970	CellStar Cell-Repellent Surface, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0.25% trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
AU565 breast cancer cells	ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
FIJI software	open-source	(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j	Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267151B
Imaris image analysis software	Bitplane		Current version 9.8
L-glutamine	Lonza	17-605E
Matrigel	Corning	354263
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC
Microscope	Zeiss	Z1 AxioVision
Penicilin streptomycin	Corning	30-0002CI
Plate centrifuge	Eppendorf
RPMI medium 1640	Gibco	11875-085
Spectral Domain Optical Coherence Tomography	ThorLabs	TEL220C1
T75 cell culture flasks	Greiner Bio-One	658175
Trastuzumab			Remnant clinical samples of Trastuzumab were used in this study, generously gifted by the Albany Medical College Pharmacy.