Fabricação e Uso de Andaimes Secos de Alginato Macroporoso para Transdução Viral de Células T

Resumo

Aqui está um protocolo para a criação de andaimes de alginato macroporoso secos que medeiam a transferência eficiente de genes virais para uso em engenharia genética de células T, incluindo células T para terapia com células CAR-T. Os andaimes demonstraram transduzir células T primárias ativadas com transdução de >85%.

Resumo

A engenharia genética de células T para terapia com células CAR-T chegou à vanguarda do tratamento do câncer nos últimos anos. As células CAR-T são produzidas pela transferência de genes virais para as células T. O atual padrão-ouro de transferência de genes virais envolve a espinoculação de placas revestidas de retronectina, o que é caro e demorado. Há uma necessidade significativa de métodos eficientes e econômicos para gerar células CAR-T. Descrito aqui é um método para a fabricação de andaimes de alginato macroporosos secos e baratos, conhecidos como andaimes Drydux, que promovem eficientemente a transdução viral de células T ativadas. Os andaimes são projetados para serem usados no lugar da espinoculação padrão-ouro de placas revestidas de retronectina semeadas com vírus e simplificam o processo de transdução de células. O alginato é reticulado com cálcio-D-gluconato e congelado durante a noite para criar os andaimes. Os andaimes congelados são liofilizados em um liofilizador por 72 h para completar a formação dos andaimes macroporosos secos. Os andaimes mediam a transferência de genes virais quando o vírus e as células T ativadas são semeados juntos no topo do andaime para produzir células geneticamente modificadas. Os andaimes produzem >85% de transdução primária de células T, o que é comparável à eficiência de transdução da espinoculação em placas revestidas de retronectina. Estes resultados demonstram que os andaimes de alginato macroporoso secos servem como uma alternativa mais barata e conveniente ao método de transdução convencional.

Introdução

A imunoterapia emergiu como um paradigma revolucionário de tratamento do câncer devido à sua capacidade de atingir especificamente tumores, limitar a citotoxicidade fora do alvo e prevenir a recaída. Particularmente, a terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CAR-T) ganhou popularidade devido ao seu sucesso no tratamento de linfomas e leucemias. A FDA aprovou a primeira terapia com células CAR-T em 2017 e, desde então, aprovou mais quatro terapias com células CAR-T 1,2,3,4,5. Os CARs têm um dom....

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo células de primazia humana e vetores retrovirais foram realizados em conformidade com as diretrizes de Segurança Biológica da Universidade Estadual da Carolina do Norte e aprovados pelo Escritório de Saúde e Segurança Ambiental. As células mononucleares do sangue periférico humano foram compradas como casacos de buffy de fontes comerciais. As células humanas primárias devem ser isoladas de frações de pelagem humana e requerem autorização de nível 2 de biossegurança e procedimentos operacionais padrão detalhados e aprovação da instituição onde o trabalho deve ocorrer. Os vetores virais, incluindo os sobrenadantes vetoriais retrovirais ....

Resultados

Esses andaimes de alginato macroporoso são fáceis de fazer e devem sair do liofilizador como discos porosos, macios e brancos. Embora não estudada neste experimento, a solução de alginato de cálcio pode ser fundida em diferentes moldes para criar andaimes de formas variadas, dependendo das necessidades do usuário ^9,10. Os andaimes são eletrostáticos e podem aderir à tampa da placa do poço ou a um dedo enluvado. A Figura 2 demonstra c.......

Discussão

A terapia celular CAR-T continua a ganhar interesse tanto para pesquisas quanto para aplicações comerciais. Apesar do sucesso que a terapia com células CAR-T teve no tratamento de cânceres no sangue, o alto custo do procedimento limita seu uso. O protocolo aqui apresentado introduz um novo método para a transferência de genes virais de células T sem a necessidade de espinoculação de placas revestidas de retronectina. A produção de andaimes de alginato macroporoso secos para mediar a transdução é relativamente simples e é.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0.5 M EDTA	Invitrogen	15575-038	UltraPure, pH 8.0
1x DPBS	Gibco	14190-144	Sem cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio
3% Ácido Acético com Azul de Metileno	Stemcell Technologies Inc	07060
Células Mononucleares Sanguíneas Perifreais Ativadas	-	-
Cálcio-D-Gluconato Alfa	Aesar fresco ou congelado	A11649
CD28.2 Anticorpo	BD	555725	1 mg/mL
CD3 Anticorpo	Miltenyi	130-093-387	100 μ g/mL
Click's Media	FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS	9195
DI Water	-	-
Glutamax	Gibco	35-050-061
HyClone FBS	Cytvia	SH3039603
HyClone RPMI 1640 Media	Cytvia	SH3009601
Penicilina-estreptomicina (P/S)	Gibco	15-140-122
Células mononucleares do sangue periférico	-		PRONOVA
UP MVG	NovaMatrix	4200101	fresco
IL-15 humano recombinante	Peprotech	200-15	5 ng / mL
IL-7 humana recombinante	Peprotech	200-07	10 ng / mL
Retrovírus	-		1 x 106< / sup> TU / Ml

ou congelado