Modelo de pele de xenoenxerto para manipular respostas imunes humanas in vivo

Summary

O presente protocolo descreve como enxertar pele humana em camundongos diabéticos não obesos (NOD)-scid interleucina-2 receptor de cadeia gama (NSG) camundongos. Uma descrição detalhada da preparação da pele humana para transplante, preparação de camundongos para transplante, transplante de pele humana de espessura dividida e procedimento de recuperação pós-transplante estão incluídas no relatório.

Abstract

O modelo de xenoenxerto de pele humana, no qual a pele do doador humano é transplantada para um hospedeiro de camundongo imunodeficiente, é uma opção importante para a pesquisa translacional em imunologia da pele. A pele murina e humana diferem substancialmente na anatomia e composição das células imunes. Portanto, os modelos tradicionais de camundongos têm limitações para a pesquisa dermatológica e a descoberta de medicamentos. No entanto, xenotransplantes bem-sucedidos são tecnicamente desafiadores e exigem uma preparação ideal do local do espécime e do enxerto de camundongo para a sobrevivência do enxerto e do hospedeiro. O presente protocolo fornece uma técnica otimizada para transplante de pele humana em camundongos e discute considerações necessárias para os objetivos experimentais a jusante. Este relatório descreve a preparação apropriada de uma amostra de pele de doador humano, montagem de uma configuração cirúrgica, preparação de camundongo e local cirúrgico, transplante de pele e monitoramento pós-cirúrgico. A adesão a esses métodos permite a manutenção de xenoenxertos por mais de 6 semanas após a cirurgia. As técnicas descritas abaixo permitem a máxima eficiência do enxerto devido ao desenvolvimento de controles de engenharia, técnica estéril e condicionamento pré e pós-cirúrgico. O desempenho adequado do modelo de xenoenxerto resulta em amostras de enxerto de pele humana de longa duração para caracterização experimental de pele humana e testes pré-clínicos de compostos in vivo.

Introduction

Modelos de camundongos são frequentemente usados para fazer inferências sobre a biologia humana e a doença, em parte devido à sua reprodutibilidade experimental e capacidade de manipulação genética. No entanto, a fisiologia do camundongo não recapitula completamente os sistemas de órgãos humanos, particularmente a pele, e, portanto, tem limitações para uso como modelo pré-clínico no desenvolvimento de fármacos¹. As diferenças anatômicas entre a pele de camundongos e humanos incluem diferenças nas espessuras e arquitetura epitelial, falta de glândulas sudoríparas écrinas murinas e variações no ciclo capilar². Além disso, tanto os braços inato quanto o adaptativo do sistema imunológico são divergentes entre as duas espécies³. A pele de camundongo contém uma população imune única de células T epidérmicas dendríticas (DETCs), tem uma maior abundância de células T γδ dérmicas e varia na localização do subconjunto de células imunes em comparação com o tecido humano⁴. Portanto, os achados experimentais sobre a biologia da pele humana e a inflamação se beneficiam da validação com tecido humano. Embora os sistemas de cultura in vitro e organoides sejam ferramentas amplamente utilizadas para o estudo do tecido humano, esses sistemas são limitados pela reconstituição imune ausente ou incompleta e pela falta de conexão com a vasculatura periférica⁵. O modelo humanizado de transplante de pele de xenoenxerto visa permitir a manipulação terapêutica ou biológica de vias imunes e não imunes em tecidos humanos in vivo.

O modelo de xenoenxerto de pele humana tem sido utilizado para estudar a fisiologia e farmacologia da pele, analisar a rejeição e as respostas imunes, dissecar os mecanismos do câncer de pele humano e entender as doenças de pele e a cicatrização de feridas⁶. Embora aplicável a vários campos de pesquisa da pele, o modelo de xenoenxerto tem menor rendimento do que os estudos in vitro e não tem a facilidade de manipulação genética empregada em modelos de camundongos. Os pontos de tempo dentro deste modelo podem variar de semanas a meses, e o enxerto bem-sucedido requer instalações e equipamentos apropriados para realizar essas cirurgias. No entanto, o modelo de xenoenxerto fornece contexto biológico e fisiológico aos experimentos, enquanto os sistemas de cultura organoides, como os explantes de tecidos, muitas vezes requerem a replicação de uma miríade de partes móveis, como sinais exógenos, em intervalos de tempo específicos⁷. Portanto, este modelo é melhor utilizado para validar ainda mais os achados observados in vitro e dentro de modelos de camundongos, ou para trabalhos que de outra forma não são biologicamente viáveis. O uso apropriado do modelo de xenoenxerto oferece uma oportunidade única para estudar e manipular o tecido humano intacto in vivo.

A otimização do modelo de transplante de pele de xenoenxerto tem contado com décadas de pesquisa para preservar a integridade do enxerto ao longo do tempo. Crítico para esse processo é a utilização do camundongo receptor de cadeia gama (NSG) não obeso diabético (NOD) e scid interleucina-2, que não possui células imunes adaptativas B e T, células NK funcionais e tem deficiências em macrófagos e células dendríticas⁸. A natureza imunodeficiente desses hospedeiros NSG permite o transplante de células hematopoiéticas humanas, cânceres derivados de pacientes e pele ^8,9,10. Apesar desse ambiente imunossupressor do hospedeiro, a supressão adicional das respostas imunes neutrofílicas de camundongos pela administração de anti-GR1 é necessária para o sucesso do enxerto¹⁰. Os principais obstáculos no transplante de tecido intacto são infecção, rejeição e dificuldade em restabelecer o fluxo sanguíneo para o enxerto, às vezes levando à perda da integridade dérmica e epidérmica¹¹. Técnicas que incluem a administração de anti-FR1 e o uso de profundidade apropriada do enxerto melhoram a sobrevida do enxerto¹⁰. A otimização meticulosa possibilita a realização de transplantes de pele de xenoenxerto humano em camundongos NSG com alta eficiência e taxas de sobrevivência, variando de 90% a 100%.

Protocol

O presente estudo foi aprovado e realizado em conformidade com os protocolos UCSF IACUC (AN191105-01H) e IRB (13-11307). Amostras de pele, descartadas como parte de procedimentos cirúrgicos eletivos de rotina, como o reparo de hérnia, foram utilizadas para a presente pesquisa. As amostras de pele são desidentificadas e certificadas como Pesquisa Não Humana ou, se informações de identificação clínica forem necessárias para análises a jusante, os pacientes forneceram consentimento por escrito sob o protocolo IRB…

Representative Results

Xenoenxertos de pele humana foram realizados em camundongos NSG dentro de uma instalação animal de super-barreira. O sucesso foi definido pela sobrevida prolongada do enxerto e do rato e pela saúde comportamental dos camundongos pós-transplante. A baixa sobrevida durante a semana seguinte à cirurgia foi inicialmente observada como a maior barreira para o sucesso experimental, com até 50% dos camundongos necessitando de eutanásia. Melhorar a técnica estéril e melhor suporte das temperaturas corporais do rato dura…

Discussion

O modelo de transplante de pele de xenoenxerto de camundongo é uma técnica fundamental para dissecar mecanicamente as respostas imunes da pele humana em um ambiente in vivo ¹⁴. O sucesso dos transplantes de xenoenxerto de pele depende do preparo adequado de camundongos e espécimes de pele e camundongos e da adesão a métodos de cirurgia asséptica de roedores¹⁵. O resfriamento rápido e o armazenamento adequado de amostras de pele a temperaturas frias em meios …

Materials

10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	SF100-20	Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB	surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)	Thermo Fischer	56-0451-82	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5	BioXcell	BE0075	Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3)	BD Biosciences	340939	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)	eBioscience	47-9956-42	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches	VWR	89140-800	For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4	Biolegend	317438	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)	Biolegend	301042	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)	Biolegend	317328	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL	Covetrus	059122	Analgesia
Carprofen 50 mg/mL	Zoetis	NADA # 141-199	Analgesia
Collagenase Type IV	Worthington	4188	Skin digestion
D42 Dermatome blade	Humeca	5.D42BL10	dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42	Humeca	4.D42	dermatome
Disposable Scalpel	Bard-Parker	371610	skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5	Cole-Parmer	UX-10915-03	To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors	medicon	02.04.10	sample preparation and mouse dissection
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent	eBioscience	00-5521-00	Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)	eBioscience	48-4776-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers	Kent	CL8787-KIT	hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin	Fisher Scientific	6765040	H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin	Fisher Scientific	6765015	H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30)	Tonbo Biosciences	35-0459-T100	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps	medicon	07.60.07	sample preparation and mouse dissection
Gauze	Fisherbrand	22-362-178	Sample preparation
Heating lamp	Morganville Scientific	HL0100	Post-surgical care
Heating pads 4" x 10"	Pristech	20415	Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes	BD	329410	drug administration
Isoflurane	United States Pharmacopeia (USP)	NDC 66794-013-25	Anesthesia
Isoflurane machine	VetEquip	911103	Anesthesia
Nair for Men	Nair	‎ 10022600588556	hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17478-235-35	eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	The Jackson Laboratory	005557	Mice
Paper towels	Kleenex	100848	May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)	BD Biosciences	557938	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)	BD Biosciences	561283	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)	eBioscience	46-1529-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x	eBioscience	00-8333-56	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm	Corning	430597	Sample storage
Plastic Wrap	Fisherbrand	22-305-654	Site preparation
Providone-Iodine Swab stick	PDI	S41350	Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)	Se Lab Group Inc	NC9066511	For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups	Fisher Scientific	22-150-266	sample storage
Sterile alcohol prep pad	Fisherbrand	22-363-750	skin preparation
Sterile PBS	Gibco	14190-144	Media for sample storage
Sterile saline	Hospira	NDC 0409-4888-02	For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”	3M	1626	transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”	Kendall	414600	wound dressing
Violet 510 Ghost Dye	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Flow cytometry analysis: Viability dye