Viene descritta una procedura per la consegna di una soluzione ablativa chimica all’albero duttale mammario del ratto per il trattamento preventivo guidato da immagini del cancro al seno. Le cellule epiteliali mammarie possono essere mirate con danni tissutali collaterali minimi attraverso l’incannulamento direttamente nell’apertura del capezzolo e l’infusione intraduttale di una soluzione ablativa a base di etanolo al 70%.
Ci sono ancora un numero limitato di interventi primari per la prevenzione del cancro al seno. Per le donne ad alto rischio di sviluppare il cancro al seno, l’intervento più efficace è la mastectomia profilattica. Questa è una procedura chirurgica drastica in cui le cellule epiteliali mammarie che possono dare origine al cancro al seno vengono completamente rimosse insieme al tessuto circostante. L’obiettivo di questo protocollo è dimostrare la fattibilità di una procedura intraduttale minimamente invasiva che potrebbe diventare un nuovo intervento primario per la prevenzione del cancro al seno. Questa procedura locale ablerebbe preferenzialmente le cellule epiteliali mammarie prima che possano diventare maligne. Metodi intraduttali per fornire soluzioni direttamente a queste cellule epiteliali in modelli di roditori di cancro al seno sono stati sviluppati presso la Michigan State University e altrove. La ghiandola mammaria del ratto è costituita da un singolo albero duttale che ha un’architettura più semplice e lineare rispetto al seno umano. Tuttavia, i modelli di ratto indotti chimicamente di cancro al seno offrono strumenti preziosi per studi proof-of-concept di nuovi interventi preventivi e scalabilità dai modelli murini agli esseri umani. Qui viene descritta una procedura per la somministrazione intraduttale di una soluzione ablativa a base di etanolo contenente nanoparticelle di ossido di tantalio come agente di contrasto a raggi X e cellulosa etilica come agente gelificante nell’albero duttale mammario del ratto. La somministrazione di reagenti acquosi (ad es. composti citotossici, siRNA, AdCre) mediante iniezione intraduttale è stata descritta in precedenza in modelli murini e di ratto. Questa descrizione del protocollo enfatizza i cambiamenti metodologici e le fasi che riguardano unicamente la fornitura di una soluzione ablativa, la considerazione della formulazione per ridurre al minimo gli effetti collaterali locali e sistemici della soluzione ablativa e l’imaging a raggi X per la valutazione in vivo del riempimento dell’albero duttale. Le tecniche di fluoroscopia e micro-CT consentono di determinare il successo della somministrazione della soluzione ablativa e l’entità del riempimento duttale dell’albero grazie alla compatibilità con il mezzo di contrasto contenente tantalio.
Per le donne negli Stati Uniti1, il cancro al seno (BC) continua ad essere il tipo di cancro più diagnosticato e causa più morti di qualsiasi altro tipo di cancro tranne il cancro del polmone. Le proiezioni per il 2022 stimano che 51.400 donne saranno diagnosticate con carcinoma in situ e 287.850 donne saranno diagnosticate con carcinoma invasivo e che 43.600 donne moriranno di BC1. Nonostante la prevalenza e la mortalità associate alla BC, ci sono poche opzioni disponibili per la prevenzione primaria e la ricerca traslazionale su nuovi interventi poiché la prevenzione primaria non è prioritaria dalle agenzie federali2. La mastectomia profilattica è l’intervento più efficace per la prevenzione primaria. Tuttavia, questa procedura è raccomandata solo per gli individui ad alto rischio perché è un intervento chirurgico importante con conseguenze che cambiano la vita3. Questo intervento comporta la rimozione completa delle cellule epiteliali mammarie da cui si sviluppa la carcinogenesi e del normale tessuto circostante. Gli individui sono spesso dissuasi dall’utilizzare questa procedura come prima opzione di intervento primario a causa dell’impatto negativo dello stress fisico, psicologico e sociale. Per questi motivi, anche alcuni individui ad alto rischio scelgono di non sottoporsi a questa procedura e scelgono invece l’attesa vigile o strategie di sorveglianza simili3. In una precedente pubblicazione, la somministrazione del 70% di etanolo (EtOH) direttamente nell’albero duttale dei modelli murini è stata efficace nell’ablazione chimica delle cellule epiteliali mammarie con danni limitati al tessuto normale adiacente e nel prevenire la formazione di tumori al seno4. EtOH è utilizzato in molteplici applicazioni cliniche come agente ablativo per il trattamento locale di alcuni tumori o agente sclerosante per il trattamento locale di gonfiore artero-venoso e malformazioni 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . La bassa tossicità e il profilo di sicurezza dell’EtOH sono ben consolidati, poiché in alcune procedure possono essere somministrati fino a 50 ml di EtOH al 95% per sessione 5,10.
La rimozione completa delle cellule epiteliali mammarie da cui si sviluppa BC è la componente più cruciale sia della mastectomia profilattica che della somministrazione locale di una soluzione ablativa. Pertanto, la conferma del completo riempimento duttale dell’albero è necessaria per garantire che la soluzione ablativa sia entrata in contatto diretto con tutte le cellule epiteliali mammarie. La fornitura di una soluzione all’interno dell’albero duttale (o degli alberi) e la sua visualizzazione mediante fluoroscopia o duttografia guidata da immagini sono possibili attraverso procedure cliniche già esistenti15,16,17. Pertanto, sarà possibile implementare e valutare prontamente questa procedura negli studi clinici. Un passo fondamentale per stabilire l’efficacia e la fattibilità traslazionale dell’ablazione intraduttale (ID) come nuovo intervento per la prevenzione primaria sarà quello di dimostrare la fattibilità di questo approccio di visualizzazione a raggi X in modelli animali di dimensioni e complessità crescenti della loro architettura ad albero duttale 4,18,19. Un protocollo che scala questa procedura ablativa dal topo20 ai modelli di ratto è descritto qui. Mentre gli alberi duttali di topo e ratto hanno una struttura lineare e un modello di ramificazione simili, l’albero duttale del ratto è proporzionalmente più grande ed è circondato da uno stroma molto più denso. Abbiamo implementato un metodo in laboratorio per iniettare con successo ogni ghiandola mammaria in un ratto in una serie di sessioni settimanali con una soluzione ablativa contenente un mezzo di contrasto. La distanza tra le sessioni è necessaria per garantire che gli animali abbiano effetti collaterali minimi di EtOH (Figura 1 e Figura 2). La procedura prevede l’iniezione della soluzione ablativa direttamente nell’apertura del capezzolo di un ratto anestetizzato con isoflurano con un ago da 33 G. Alcuni miglioramenti chiave della procedura includono l’uso di un trattamento antinfiammatorio esteso, l’iniezione di volumi più elevati per albero duttale rispetto a21 suggerito e siringhe a tenuta di gas per liquidi e gas. La durata del trattamento con 5 mg/kg di carprofen (un FANS) da 48 ore prima a 1 settimana dopo le iniezioni di ID è paragonabile al protocollo antinfiammatorio utilizzato per la terapia sclerosante della malformazione venosa in clinica. Il trattamento viene eseguito su pazienti in anestesia sistemica seguiti da 2 giorni di farmaci antinfiammatori come i FANS. Il trattamento antinfiammatorio può essere prolungato per qualche giorno in più per ridurre l’infiammazione locale e qualsiasi potenziale dolore13. Come nei topi20, l’iniezione intraperitoneale di una soluzione di saccarosio al 5% mitiga l’effetto a breve termine dell’intossicazione da alcol nei ratti. I ratti possono essere iniettati con fino a 1 ml di EtOH al 70% (fino a 4 condotti; 0,2 g/dL di contenuto di EtOH nel sangue) in una singola sessione quando somministrati con questa soluzione di saccarosio; gli animali si riprendono completamente entro 4 ore dopo le iniezioni di ID. Eseguiamo sessioni sequenziali per consentire un tempo di recupero sufficiente quando si iniettano più di 4 ghiandole e / o concentrazioni più elevate di EtOH. L’intossicazione da alcol nelle donne sarà molto meno probabile poiché l’iniezione ID di tutti gli alberi duttali in entrambi i seni, assumendo 16 condotti principali16,17 e 2 ml per condotto22,23, con il 70% di EtOH comporterebbe meno di 0,1 g / dL di contenuto di EtOH nel sangue e potrebbe causare lieve compromissione.
L’imaging a raggi X consente di determinare il successo della consegna intraduttale in ogni singola ghiandola e se l’intero albero duttale è riempito (Figura 1, Figura 2, Figura 3). L’imaging fluoroscopico in tempo reale in preparazione per la scansione micro-CT e / o la ricostruzione 3D dei dati del file DICOM può essere utilizzato per valutare l’entità della consegna della soluzione nell’albero duttale e qualsiasi perdita nello stroma. L’uso della fluoroscopia può aiutare a limitare la dose complessiva di radiazioni imposta all’animale. La tecnica di fluoroscopia si avvicina più strettamente all’applicazione clinica prevista per la guida dell’immagine di questo trattamento ablativo. Il confronto tra Isovue contenente iodio approvato dalla FDA e nanoparticelle di ossido di tantalio (TaOx) è stato eseguito al fine di perfezionare ulteriormente l’utilità della soluzione ablativa 4,19. È stato trovato che TaOx è un mezzo di contrasto micro-CT superiore a Isovue per la visualizzazione del riempimento iniziale dell’albero duttale nei topi 4,19. Qui, dimostriamo che TaOx è un agente di contrasto adatto per visualizzare il riempimento iniziale dell’albero duttale del ratto (Figura 2 e Figura 3). Sia nella ricerca traslazionale che nelle applicazioni di pratica clinica, l’agente gelificante etilcellulosa (EC) è stato aggiunto alla soluzione EtOH per ridurre al minimo la diffusione dalle regioni target previste 13,14,24,25,26,27,28,29. Gli studi hanno dimostrato che l’aggiunta fino all’1,5% di EC a soluzioni ablative contenenti EtOH è compatibile con l’imaging basato su TaOx (Figura 3). Questi e ulteriori perfezionamenti alla soluzione ablativa possono aiutare nella pronta traduzione di questa procedura guidata da immagini alla clinica.
Come mostrato qui, la somministrazione di ID del 70% di EtOH abla preferenzialmente le cellule epiteliali mammarie con danni collaterali limitati allo stroma e alla vascolarizzazione circostanti nei topi4. L’ablazione locale dell’albero duttale è efficace nel prevenire la formazione di tumori nei modelli murini4. Qui, dimostriamo che questa procedura ablativa può essere scalata fino ai ratti.
Questo è il prossimo passo nel percorso verso la traduzione di questa procedura ablativa come intervento alternativo alla mastectomia profilattica per la prevenzione primaria del cancro al seno in individui ad alto rischio. L’aggiunta di nanoparticelle di TaOx come mezzo di contrasto a raggi X alla soluzione ablativa consente di valutare l’efficacia della soluzione nel prevenire la formazione del tumore, in quanto è possibile determinare se la procedura ha avuto successo o meno nel riempire completamente l’albero duttale. L’uso della fluoroscopia per visualizzare la ghiandola mammaria iniettata rispecchia ciò che probabilmente verrà fatto in clinica per guidare questa procedura ID. La guida dell’immagine di quanto la soluzione ha riempito l’albero duttale e quando interrompere l’infusione sarà un aspetto chiave dell’implementazione clinica per garantire il massimo riempimento di ciascun albero duttale. Le procedure di risoluzione dei problemi e i suggerimenti utili sono elencati nella tabella 1. L’efficacia di questa procedura ablativa richiede che la soluzione infusa entri in contatto diretto con tutte le cellule epiteliali per massimizzare il tasso di uccisione cellulare. Le cellule epiteliali di riserva all’interno di uno o più alberi potrebbero eventualmente servire come fonte per lo sviluppo di BC. Gli altri gruppi hanno riportato la consegna ID di particelle virali (ad esempio, componenti dei sistemi Cre / LoxP e / o Cas9 / CRISPR), ormoni e antagonisti ormonali (ad esempio, prolattina, fulvestrant), agenti chemioterapici (ad esempio, cisplatino), siRNA e / o anticorpi o altri agenti bersaglio nei topi 4,19,21,35,36,37,38,39,40, 41,42,43,44,45, ratti 21,33,46,47,48 e/o conigli 18,49,50,51,52,53 . L’incannulamento riuscito di un massimo di otto alberi duttali per seno umano per la somministrazione locale di chemioterapia è stato riportato in studi clinici indipendenti 47,54,55. La guida dell’immagine per l’infusione di queste altre soluzioni finalizzate alla prevenzione del tumore o orientate al trattamento locale massimizzerebbe allo stesso modo la loro efficacia.
La scalabilità e la raffinatezza di questa procedura dal topo all’albero duttale del ratto è dimostrata qui. La nanoparticella TaOx nell’albero duttale murino 4,19 e ratto (dati non pubblicati) fornisce immagini ad alta risoluzione che superano gli agenti di contrasto a raggi X contenenti iodio approvati dalla FDA. Allo stesso modo, non siamo a conoscenza di altri approcci di imaging dell’albero duttale nei topi40,41 o in altri modelli animali18 che possono fornire una risoluzione comparabile a TaOx. Rilevante per la traduzione clinica è il fatto che l’effetto gelificante della CE in questi modelli di ratto di dimensioni intermedie è un perfezionamento della formulazione che consente di ridurre al minimo il danno tissutale collaterale. Mentre continuiamo a valutare questa procedura di identificazione ablativa per la sua capacità di prevenire la BC, saremo in grado di determinare, più precisamente, da quale ghiandola BC si sviluppa attraverso le informazioni aggiuntive fornite dall’imaging dopo la consegna dell’ID in modelli di BC indotti chimicamente e in altri modelli di ratto. Questi dati determineranno la sicurezza di questa procedura e individueranno eventuali preoccupazioni o carenze sul fatto che gli alberi duttali trattati parzialmente o con successo possano essere più inclini a sviluppare BC in una donna ad alto rischio.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto, in parte, dalle sovvenzioni R21 CA226579 e R01 CA258314 del National Cancer Institute a LFS e dalla sovvenzione R01 EB029418 del National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering all’EMS. Siamo grati alla struttura MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core per l’uso dei loro sistemi di imaging e competenze tecniche. Ringraziamo la dottoressa Danielle Ferguson per aver esaminato i contenuti del video e le cifre per l’aderenza alle linee guida sul benessere degli animali.
AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
Ethyl cellulose | Acros Organics | 9004-57-3 | For intraductal injection |
Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
Model 1750 TTL, PTFE Luer Lock Syringe, 500μL | Hamilton | 81220 | For intraductal injection |
Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
Metal Hub Needle, 33 gauge, custom (30° bevel angle, 0.4 in, point style 4) | Hamilton | 7747-01 | For intraductal injection |
Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |