二次アドヒアランス法によるラット骨からの単球-マクロファージ系譜細胞の単離
Summary
ここでは、二次アドヒアランス法と呼ばれるSDラットからBMMを単離するためのプロトコルを提示する。
Abstract
骨塩密度が低下すると、骨が骨折する可能性が高くなり、患者の生活の質に悪影響を及ぼします。骨の成長および発達は、主に骨芽細胞および破骨細胞によって調節される。破骨細胞は骨髄単球 – マクロファージ細胞(BMM)に由来することが広く受け入れられている。BMMおよび他の造血幹細胞は、骨髄腔内に位置する。したがって、異なる異種の細胞集団から単一の安定BMMを単離することは大きな課題である。ここでは、二次アドヒアランス法と呼ばれるSDラットからBMMを単離するためのプロトコルを提示する。初代培養で24~48時間培養した付着細胞を回収した。フローサイトメトリー分析により、細胞の約37.94%がCD11b/c+(単球-マクロファージ表面抗原)であることが示された。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色およびウェスタンブロット分析は、BMMが インビトロで破骨細胞に分化できることを実証した。以上の知見は、二次接着細胞が破骨細胞分化研究に好適な細胞モデルと考えられることを示唆した。
Introduction
骨髄中に存在する単球・マクロファージ系譜細胞が血液単球や組織マクロファージに分化できることが報告されている1,2。上記の細胞は、骨の成長と発達のバランスをとるために破骨細胞に分化することができ、インビボで破骨細胞を誘導する細胞モデルとして一般的に使用されている3,4。骨髄は、骨髄間葉系幹細胞、骨髄単球 – マクロファージ細胞(BMM)、造血幹細胞、内皮細胞、および免疫細胞を含むがこれらに限定されない、いくつかの異なるタイプの細胞を含む特別な組織である。実際、いくつかの以前の研究は、長骨の骨髄腔から突出した付着細胞が骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、または脂肪細胞に分化する可能性を示唆した5、6、7、8。異なる均質な細胞集団を作製するために、異なる単離および培養方法が使用されてきたが、様々な異なる細胞型からBMMを単離および培養することには依然として大きな課題がある。
骨髄単核球マクロファージ(BMSC)を抽出するためにいくつかの方法が開発されている。しかしながら、これらの方法の大部分は、複雑な9、10、11である。たとえば、密度勾配遠心分離には特殊なキットが必要であり、操作には時間がかかり面倒です。この方法は、大量の血液サンプルからのBMMの単離には適しているが、骨髄サンプル9、12、13からはそうではない。さらに、コラゲナーゼ消化を使用して組織サンプルを抽出することは、複雑で時間のかかる手順です。この方法は、骨髄サンプルからのBMMの単離には推奨されない14、15。さらに、流動分離は高度に精製された単球/マクロファージ集団をもたらす可能性がありますが、非常に大きなサンプルサイズと高い機器および機器要件が必要です10,16。さらに、マイクロビーズ濃縮法は極めて高価であり、一般の実験室17では実現不可能である。
したがって、現在の研究では、骨髄からの単核球マクロファージの単離のために、便利で、速く、そして安価な方法が提案された。異なる時点で接着した骨髄細胞を用いて、二次接着法を用いてBMMを単離した。上記の方法で抽出されたBMMは、 インビトロで破骨細胞の形成を誘導することができ、したがってイン ビトロでの骨粗鬆症の将来の研究のための簡単で便利な細胞モデルを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
破骨細胞は、骨疾患の発生および発症に関与する最も重要な細胞型の1つであり、骨疾患研究の主要な目的の1つである20。単球/マクロファージは破骨細胞に分化することができる。単核マクロファージ(RAW264.7細胞)は高価すぎて購入できず、培養中に活性化されやすいため、この細胞株を用いた 体外 分化実験を行うことは困難である。骨髄から単球/マクロファージを?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、浙江省自然科学財団の支援を受けました(助成金番号。LY19H060001)および浙江省漢方薬科学技術計画プロジェクト(番号2022ZB093)。
Materials
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
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