Здесь мы представляем протокол изоляции БММ от крыс SD, называемый методом вторичной адгезии.
При снижении минеральной плотности костной ткани кости чаще ломаются, что негативно сказывается на качестве жизни пациента. Рост и развитие костей в основном регулируются остеобластами и остеокластами. Широко признано, что остеокласты получают из моноцитарно-макрофаговых клеток костного мозга (BBM). БММ и другие гемопоэтические стволовые клетки расположены в полости костного мозга. Поэтому выделение одиночных стабильных БММ из разных и гетерогенных клеточных популяций является огромной проблемой. Здесь мы представляем протокол изоляции БММ от крыс SD, называемый методом вторичной адгезии. Адгезивные клетки, культивируемые в течение 24-48 ч в первичной культуре, собирали. Проточный цитометрический анализ показал, что примерно 37,94% клеток были CD11b/c+ (моноцитарно-макрофагальный поверхностный антиген). Окрашивание тартрат-резистентной кислой фосфатазой (TRAP) и анализ вестерн-блоттинга показали, что BBM могут дифференцироваться в остеокласты in vitro. Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что вторичные клетки адгезии могут рассматриваться как подходящая клеточная модель для исследования дифференцировки остеокластов.
Сообщалось, что клетки моноцитарно-макрофаговой линии, существующие в костном мозге, могут дифференцироваться в моноциты крови и тканевые макрофаги 1,2. Вышеуказанные клетки, которые могут дифференцироваться в остеокласты, чтобы сбалансировать рост и развитие костей, обычно используются в качестве клеточной модели для индуцирования остеокластов in vivo 3,4. Костный мозг представляет собой специальную ткань, содержащую несколько различных типов клеток, которые включают, но не ограничиваются только мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга, моноцитарно-макрофагальными клетками (БММ), гемопоэтическими стволовыми клетками, эндотелиальными клетками и иммунными клетками. Фактически, несколько предыдущих исследований показали, что адгезивные клетки, выброшенные из полости костного мозга длинной кости, могут дифференцироваться в остеобласты, остеокласты, хондроциты или адипоциты 5,6,7,8. Хотя различные методы изоляции и культивирования использовались для получения различных однородных клеточных популяций, по-прежнему существуют большие проблемы в выделении и культивировании БММ из множества различных типов клеток.
Было разработано несколько методов извлечения мононуклеарных макрофагов костного мозга (BMSCs). Однако большинство из этих методов являются сложными 9,10,11. Например, центрифугирование градиента плотности требует специализированного комплекта, а операция занимает много времени и громоздко. Этот метод подходит для выделения БММ из больших объемов образцов крови, но не из образцов костного мозга 9,12,13. Кроме того, извлечение образцов тканей с помощью переваривания коллагеназы является сложной и трудоемкой процедурой; этот метод не рекомендуется для выделения БММ из образцов костного мозга14,15. Кроме того, хотя разделение потока может привести к высокоочищенным популяциям моноцитов/макрофагов, оно требует очень больших размеров выборки и высоких требований к инструментам и оборудованию10,16. Кроме того, метод обогащения микрогранул чрезвычайно дорог и неосуществим в общей лаборатории17.
Поэтому в текущем исследовании был предложен удобный, быстрый и дешевый метод выделения мононуклеарных макрофагов из костного мозга. Клетки костного мозга, приклеенные в течение разных временных точек, использовались для выделения БММ с использованием метода вторичной адгезии. BBM, извлеченные с помощью вышеуказанного метода, могут индуцировать образование остеокластов in vitro, обеспечивая тем самым простую и удобную клеточную модель для будущего изучения остеопороза in vitro.
Остеокласты являются одним из наиболее значимых типов клеток, участвующих в возникновении и развитии заболеваний костей, а также одним из основных объектов исследования заболеваний костей20. Моноциты / макрофаги могут дифференцироваться в остеокласты. Поскольку мононукл?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (грант No. LY19H060001) и Проект научно-технического плана традиционной китайской медицины провинции Чжэцзян (No 2022ZB093).
35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
Cell culture dish | corning | 430167 | |
Cell culture flask | corning | 430168 | |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
PBS | Biosharp | BL302A | |
RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |