JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

צינור לחקר המבנים ומסלולי האיתות של קולטני ספינגוזין 1-פוספט

Published: June 08, 2022
doi:
10.3791/64054
, , , , , ,
1Division of Nephrology and Kidney Research Institute, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital,Sichuan University, 2Department of Neurosurgery, West China Hospital,Sichuan University

Summary

S1P מפעיל את ההשפעות הפיזיולוגיות המגוונות שלו באמצעות תת-משפחת קולטני S1P (S1PRs). כאן, צינור מתואר כדי להרחיב על המבנים והתפקוד של S1PRs.

Abstract

ליזופוספוליפידים (LPLs) הם ליפידים ביו-אקטיביים הכוללים ספינגוזין 1-פוספט (S1P), חומצה ליזופוספטידית וכו ‘. S1P, תוצר מטבולי של ספינגוליפידים בקרום התא, הוא אחד ה-LPLs המאופיינים בצורה הטובה ביותר המווסת מגוון תגובות פיזיולוגיות תאיות באמצעות מסלולי איתות המתווכים על ידי קולטני ספינגוזין 1-פוספט (S1PRs). זה רמז לכך שמערכת האיתות S1P-S1PRs היא מטרה טיפולית פוטנציאלית יוצאת דופן להפרעות, כולל טרשת נפוצה (MS), הפרעות אוטואימוניות, סרטן, דלקת ואפילו COVID-19. S1PRs, תת-קבוצה קטנה ממשפחת הקולטן המצומד לחלבון G מסוג A (GPCR), מורכבת מחמישה תתי-סוגים: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 ו-S1PR5. עם זאת, היעדר מידע מבני מפורט מעכב את גילוי התרופה המכוון ל-S1PRs. כאן, יישמנו את שיטת המיקרוסקופיה הקריו-אלקטרונית כדי לפתור את המבנה של קומפלקס S1P-S1PRs, והבהרנו את מנגנון ההפעלה, זיהוי תרופות סלקטיבי וצימוד חלבון G באמצעות מבחנים פונקציונליים מבוססי תאים. קולטני ליזופוספוליפידים אחרים (LPLR) ו- GPCRs יכולים גם הם להיחקר באמצעות אסטרטגיה זו.

Introduction

ספינגוזין-1-פוספט (S1P), תוצר מטבולי של ספינגוליפידים בקרום התא, היא מולקולת איתות ליזופוספטידית הנמצאת בכל מקום ומערבת פעילויות ביולוגיות שונות, כולל סחר בלימפוציטים, התפתחות כלי דם, שלמות האנדותל וקצב לב 1,2,3. S1P מפעיל את ההשפעות הפיזיולוגיות המגוונות שלו באמצעות חמישה תת-סוגים של קולטני S1P (S1PRs 1-5); S1PRs נמצאים במגוון רקמות ומפגינים העדפות ייחודיות לחלבוני Gבמורד הזרם 4,5. S1PR1 מוצמד בעיקר לחלבון Gi, אשר לאחר מכן מעכב את ייצור cAMP; S1PR2 ו-S1PR3 משולבים עם Gi, Gq ו-G12/13, ואות מתמר S1PR4 ו-S1PR5 דרך Gi ו-G12/136.

איתות S1P-S1PR הוא יעד טיפולי קריטי למחלות מרובות, כולל הפרעות אוטואימוניות7, דלקת8, סרטן9 ואפילו COVID-1910. בשנת 2010, פינגולימוד (FTY720) קיבל רישיון כתרופה ראשונה מסוגה המכוונת נגד S1PRs לטיפול בטרשת נפוצה חוזרת (MS)11. עם זאת, הוא מסוגל להיקשר לכל S1PRs למעט S1PR2, בעוד שקשירה לא ספציפית ל- S1PR3 גורמת לבצקת של קליפת המוח, כיווץ כלי הדם והסימפונות ודליפת אפיתל הריאה12. כאסטרטגיה חלופית להגברת הסלקטיביות הטיפולית, נוצרו ליגנדות ספציפיות לתת-סוג עבור הקולטן. סיפונימוד (BAF312) אושרה בשנת 2019 לטיפול בטרשת נפוצהחוזרת 13; הוא מכוון ביעילות ל-S1PR1 ול-S1PR5, בעוד שאין לו זיקה ל-S1PR3, מה שמפגין פחות תופעות לוואי בקליניקה14. בשנת 2020, מנהל המזון והתרופות האמריקאי אישר אוזנימוד לטיפול בטרשת נפוצה15. דווח כי אוזנימוד מחזיק בסלקטיביות גדולה פי 25 עבור S1PR1 מאשר עבור S1PR516. יש לציין כי בהקשר של מגפת COVID-19 הנוכחית, התגלה כי תרופות אגוניסטיות המכוונות ל- S1PRs עשויות לשמש לטיפול ב- COVID-19 על ידי שימוש בטכניקות טיפול אימונומודולטוריות17. בהשוואה לפינגולימוד, האוזנימוד הראה עליונות בהורדת הסימפטומים בחולי COVID-19 וכעת הוא עובר ניסויים קליניים10. הבנת הבסיס המבני והתפקוד של S1PRs מניחה בסיס משמעותי לפיתוח תרופה המכוונת באופן סלקטיבי ל- S1PRs18.

טכניקות רבות משמשות לחקר המידע המבני של ביו-מקרומולקולות, כולל קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ומיקרוסקופיית אלקטרונים (EM). נכון למרץ 2022, ישנם יותר מ -180,000 מבנים שהופקדו בבנק נתוני החלבון (PDB), ורובם נפתרו על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. עם זאת, עם מבנה הרזולוציה הכמעט אטומית הראשונה של TPRV1 (רזולוציה 3.4 Å) שדווחה על ידי ייפאן צ’נג ודיוויד יוליוס בשנת 201319, מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים (cryo-EM) הפכה לטכניקה מרכזית עבור מבני חלבונים, והמספר הכולל של מבני EM PDB היה יותר מ -10,000. התחומים פורצי הדרך הקריטיים הם פיתוח מצלמות חדשות להדמיה המכונות מצלמות לגילוי אלקטרונים ישירים ואלגוריתמים חדשים לעיבוד תמונה. Cryo-EM חוללה מהפכה בביולוגיה של מבנים ובגילוי תרופות מבוססות מבנה בעשורה-20 האחרון. מכיוון שהבנת האופן שבו קומפלקסים מקרומולקולריים ממלאים את תפקידיהם המורכבים בתא החי היא נושא מרכזי במדעי הביולוגיה, לקריו-EM יש פוטנציאל לחשוף קונפורמציות של קומפלקסים מולקולריים דינמיים, במיוחד עבור חלבונים טרנס-ממברניים21. קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) הם משפחת-העל הגדולה ביותר של חלבוני טרנס-ממברנה והמטרות של יותר מ-30% מהתרופות המשווקות כיום22. הפיתוח של cryo-EM תרם לפרץ של מבנים ברזולוציה גבוהה של קומפלקסים של חלבוני GPCR-G, המאפשרים קביעה מבנית של מטרות ‘בלתי פתירות’ שעדיין אינן נגישות לניתוח קריסטלוגרפי של קרני רנטגן בתכנון תרופות23. לפיכך, יישום cryo-EM מספק הזדמנות לקבוע את המבנה התלת-ממדי של GPCRs בתנאים כמעט מקומיים ברזולוציה אטומית קרובה לרזולוציה אטומית24. ההתקדמות ב- cryo-EM מאפשרת לדמיין יסודות מכניסטיים של גירוי או עיכוב GPCR, ותועלת נוספת בחשיפת אתרי הקשירה החדשים ליצירת תרופות ממוקדות GPCR25.

בהסתמך על הצעדים האדירים של טכנולוגיית cryo-EM, זיהינו מבנים של מתחמי איתות S1PR1-, S1PR3 ו-S1PR5-Gi מיוסרים לאחרונה26,27. בבני אדם, S1PRs נמצאים ברקמות שונות ומפגינים העדפות ייחודיות לחלבוני Gבמורד הזרם 4,5. S1PR1 מוצמד בעיקר לחלבון Gi, אשר לאחר מכן מעכב ייצור של 3′,5′-מחזורי של אדנוזין מונופוספט (cAMP). S1PR3 ו-S1PR5 מסוגלים גם לצימוד עם Gi 6,28. מכיוון שהפעלת קולטן מצומד Gi מפחיתה את הייצור של cAMP29, הוכנסה בדיקת cAMP לעיכוב Gi כדי למדוד את השפעות העיכוב של cAMP ללכידת שינויים פונקציונליים26,27. באמצעות גרסה מוטנטית של Photinus pyralis luciferase שבה הוכנס חלבון קושר cAMP, בדיקת cAMP זו מציעה שיטה פשוטה ואמינה לניטור פעילות GPCR באמצעות שינויים בריכוז cAMPתוך תאי 30. זוהי בדיקה תפקודית רגישה ולא רדיואקטיבית וניתן ליישם אותה כדי לנטר את האיתות בזמן אמת במורד הזרם של מגוון רחב של GPCRs למטרות גילוי תרופות31.

כאן, מסופק סיכום של השיטות הקריטיות לפתרון מצבי ההפעלה וזיהוי התרופות של S1PRs, כולל בעיקר מניפולציות cryo-EM ובדיקת cAMP של עיכוב Gi. מאמר זה נועד לספק הדרכה ניסיונית מקיפה לחקירות נוספות של המבנים והתפקודים של GPCRs.

Protocol

1. טיהור קומפלקס חלבונים S1PRs-G כדי לטהר את קומפלקס החלבון S1PRs-G האנושי, שכפלו את ה-cDNAs של S1PR1 חסר שאריות C-terminal 338-382, S1PR3 מסוג פראי, S1PR5 שנחתך עם 345-398 ב-C-terminus, ואת ה-Gi1 מהסוג הפראי לווקטור pFastBac1 ול-cDNAs של Gβ1 ו-Gγ2 מהסוג הפראי לווקטור pFastBacdual (טבלת חומרים).הערה: כל המבנים עבור S1PRs מ…

Representative Results

לפני הקפאת הדגימה של קומפלקס S1PRs-Gi, יש להפריד את הדגימה המטוהרת על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) ולנתח אותה באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג’ל. איור 2 מציג את קומפלקס S1PR3-Gi כדוגמה. חלק השיא של קומפלקס החלבון ההומוגני GPCR-G היה ממוקם בדרך כלל ב~10.5 מ”ל של הכרומטוגרפיה של אי-הכלל?…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר צינור ראשי לקביעת המבנים של S1PRs על ידי cryo-EM ומדידת עוצמת ההפעלה של S1PRs על ידי בדיקת עיכוב cAMP בתיווך Gi. כמה צעדים חיוניים להצלחת הניסוי.

כדי לטהר את קומפלקס S1PRs-Gi, יש לשים לב יותר לאיכות הנגיף ולבריאותם של תאי sf9 . הביטוי של הקולטן מופחת באופן דרמטי בתאי sf9</…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

הנתונים של קומפלקס S1PRs-Gi נקטפו במרכז Cryo-EM במערב סין באוניברסיטת סצ’ואן ובמרכז Cryo-EM באוניברסיטה הדרומית למדע וטכנולוגיה (SUSTech) ועובדו במרכז המחשוב בעל הביצועים הגבוהים Duyu באוניברסיטת סצ’ואן. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של סין (32100965 ללוס אנג’לס, 32100988 ל- W.Y., 31972916 ל- Z.S.) וקרן המחקר לפוסט-דוקטורט במשרה מלאה של אוניברסיטת סצ’ואן (2021SCU12003 עד L.C.)

Materials

0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
  2. Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence. Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).
  3. Cartier, A., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy. Science. 366 (6463), 5551 (2019).
  4. Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology. Pharmacological Research. 156, 104793 (2020).
  5. Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8. British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).
  6. Bryan, A. M., Del Poeta, M. Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity. Cellular Microbiology. 20 (5), 12836 (2018).
  7. Pelletier, D., Hafler, D. A. Fingolimod for multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).
  8. Obinata, H., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate and inflammation. International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).
  9. Pyne, N. J., Pyne, S. Sphingosine 1-phosphate and cancer. Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).
  10. Abu-Farha, M., et al. The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544 (2020).
  11. Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).
  12. Murakami, A., et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist. Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).
  13. Cao, L., et al. Siponimod for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).
  14. Scott, L. J. Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis. CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).
  15. Lamb, Y. N. Ozanimod: first approval. Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).
  16. Scott, F. L., et al. Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity. British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).
  17. McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189 (2020).
  18. O’Sullivan, C., Dev, K. K. The structure and function of the S1P1 receptor. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).
  19. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  20. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).
  21. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  22. Zhang, M., et al. Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs. Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).
  23. Renaud, J. P., et al. Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).
  24. Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM. Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).
  25. Yang, D., et al. G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7 (2021).
  26. Yuan, Y., et al. Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition. Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).
  27. Zhao, C., et al. Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes. Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).
  28. Xu, Z., et al. Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism. Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).
  29. Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor. Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).
  30. Buccioni, M., et al. Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17. Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).
  31. Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies. Methods. , (2021).
  32. Audet, M., et al. Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography. Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).
  33. Sgro, G. G., Costa, T. R. D. Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74 (2018).
  34. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  35. Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
  36. Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).
  37. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  38. Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  41. Scheres, S. H. Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3. Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).
  42. Liu, S., et al. Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate. Nature Communications. 13 (1), 731 (2022).
  43. Duan, J., et al. Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy. Nature Communications. 11 (1), 4121 (2020).
  44. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
  45. Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3′,5′-monophosphate and guanosine cyclic 3′,5′-monophosphate using acetylcholinesterase. Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).
  46. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).

Tags

Sphingosine 1-phosphate ReceptorsS1PRActivationDrug DevelopmentCryo-electron MicroscopyProtein PurificationSize Exclusion Chromatography2D ClassificationImage ProcessingAuto-picking
check_url/pt/64054?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia, F., Zhao, C., Yan, W., Shao, Z. A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors. J. Vis. Exp. (184), e64054, doi:10.3791/64054 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image