Bruk av biseksjon for å redusere mitokondrie-DNA i Bovine Oocyte

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å redusere mitokondrie-DNA-kopinumrene betydelig i en storfe oocytt (P < 0,0001). Denne metoden benytter sentrifugering og biseksjon for å redusere oocytt mitokondrier betydelig og kan gi økt sjanse for utvikling i de rekonstruerte interspecies somatiske celle kjernefysiske overføring embryoer.

Abstract

Interspecies somatisk celle kjernefysisk overføring (iSCNT) kan brukes til å redde truede arter, men to forskjellige populasjoner av mitokondrie DNA (mtDNA) eksisterer innenfor det rekonstruerte embryoet: en i mottaker ooplasma og en i donor somatisk celle. Denne mitokondrie heteroplasmien kan føre til utviklingsproblemer i embryoet og fosteret. Håndlagde kloningsprotokoller inkluderer oocytt biseksjon, som kan brukes til å redusere mtDNA-kopinummeret, noe som reduserer graden av mitokondrie heteroplasmy i et rekonstruert embryo. Sentrifugering av denuded, modne storfe oocytter produserte en synlig mitokondri-tett brøkdel på en pol av oocytten. Oocytes’ zonae pellucidae ble fjernet ved eksponering for en pronaseløsning. Biseksjon ble utført ved hjelp av et mikroblad for å fjerne den synlige mitokondrierfraksjonen. qPCR ble brukt til å kvantifisere mtDNA tilstede i DNA-prøver hentet fra hele oocytter og bisected ooplasts, noe som gir en sammenligning av mtDNA kopinumre før og etter biseksjon. Kopieringsnumre ble beregnet ved hjelp av syklusterskelverdier, en standardkurves regresjonslinjeformel og et forhold som inkluderte de respektive størrelsene på mtDNA PCR-produkter og genomiske PCR-produkter. En bovint oocytt hadde et gjennomsnittlig mtDNA-kopinummer (± standardavvik) på 137 904 ± 94 768 (n = 38). En mitokondri-utarmet ooplast hadde et gjennomsnittlig mtDNA kopinummer på 8 442 ± 13 806 (n = 33). Gjennomsnittlig mtDNA kopier til stede i en mitokondri-rik ooplast var 79,390 ± 58,526 mtDNA kopier (n = 28). Forskjellene mellom disse beregnede gjennomsnittene indikerer at sentrifugering og påfølgende biseksjon kan redusere mtDNA-kopinumrene som finnes i mitokondriene utarmet ooplast betydelig sammenlignet med den opprinnelige oocytten (P < 0,0001, bestemt av enveis ANOVA). Reduksjonen i mtDNA bør redusere graden av mitokondrie heteroplasmy i et rekonstruert embryo, muligens fremme standard embryonal og fosterutvikling. Tilskudd med mitokondrieekstrakt fra den somatiske donorcellen kan også være avgjørende for å oppnå vellykket embryonal utvikling.

Introduction

Somatisk celle kjernefysisk overføring (SCNT) inkluderer sammensmelting av en enuklet oocytt fra ett dyr og en somatisk celle fra et dyr av samme art. I de fleste tilfeller stammer oocytten og somatisk celle fra samme art, og levende fødselsrater er under 6%¹. Noe forskning innebærer bruk av interspecies SCNT (iSCNT), som inkluderer sammensmelting av en somatisk celle og oocytt som stammer fra to forskjellige arter. I disse studiene er levende fødselstall enda lavere enn i SCNT-vanligvis mindre enn 1%¹. Imidlertid har iSCNT kapasitet til å brukes som en metode for å redde truede arter, siden somatiske celler fra disse dyrene er mer tilgjengelige enn deres bakterieceller¹. Mottaker oocytter som brukes i iSCNT er ofte innenlandske eller vanlige laboratoriearter, for eksempel kyr, griser og mus. Noen forsøk så langt har lykkes med å produsere levende unge, selv om avkomene som produseres har vært intrageneriske dyr (mottaker oocyttarter og donorcellearter var medlemmer av samme slekt)^2,3,4. Intergeneric modeller (som bruker en oocytt og somatisk celle fra dyr i forskjellige slekter) har ennå ikke produsert levende dyr, og flertallet av rekonstruerte embryoer arresterer på 8-16 cellestadiet av in vitro utvikling 5,6,7,8. En mulig forklaring på denne embryonale utviklingsstansen er forekomsten av mitokondrie heteroplasmy i embryoene – tilstedeværelsen av mer enn en mitokondrier DNA (mtDNA) type i en enkelt celle. Heteroplasmy kan føre til problemer som utviklingssvikt eller svikt i embryoet eller i det levende dyret¹. Patogenese kan også forekomme senere i dyrets levetid⁹. Selv om dette problemet også er til stede i SCNT-avkom, forverrer den interspesifikke komponenten i iSCNT-embryoer problemet.

Når den embryonale mtDNA kommer fra to forskjellige arter, fungerer mottakeren oocytt mitokondrier, som representerer flertallet, ikke effektivt med donorcellens kjerne ^1,10. Større taksonomiske hull mellom de to artene som brukes i iSCNT, intensiverer sannsynligvis dette problemet; intrageneriske levende avkom produsert (Bos gaurus og Bos indicus avkom ved hjelp av Bos taurus oocytter), samt avkom produsert via tradisjonell SCNT (f.eks Ovis aries avkom ved hjelp av Ovis aries oocytes) ble vist å være chimeras (mtDNA fra to personer var til stede i disse dyrene 11,12,13). Likevel utviklet de seg mye lenger enn de intergeneriske SCNT-embryoene^14,15. Utvekslingen av informasjon mellom oocytt mitokondriene og donorcellens kjerne kan være mer vellykket i det intrageneriske embryoet enn i det intergeneriske^{embryoet 16}.

Mengden mtDNA i en moden storfe oocytt er ca. 100 ganger større enn mengden som finnes i en somatisk celle¹². Å redusere dette forholdet kan oppmuntre de somatiske celle mitokondriene til å spre seg innenfor det rekonstruerte embryoet, slik at en større befolkning av produktive mitokondrier kan være til stede¹⁶. Dette kan igjen gi mer energi til å møte kravene til det utviklende^{embryoet 15}. Tidligere forsøk på å redusere mtDNA-kopinummeret til oocytten eller embryoet inkluderer kjemisk anvendelse, mikromanipulering og supplere oocytten eller embryoet med ytterligere mitokondrier fra donorcelleartene 16,17,18,19,20. Kjemisk anvendelse (for eksempel 2′,3′-dideoxycytidine) er imidlertid ikke ideell for embryonal utvikling, og har redusert oocytt mtDNA kopitall med omtrent halvparten¹⁸. Tidligere oocytt mtDNA reduksjon ved mikromanipulering har bare fjernet et gjennomsnitt på 64% av oocyttens mtDNA¹⁷. Selv om tilskudd av donorcelle mitokondrier kan være et levedyktig alternativ, har bruken ennå ikke produsert et levende intergenerisk dyr i iSCNT-studiene²¹.

Bruk av biseksjon for å redusere oocytt mtDNA kopinummer er ennå ikke brukt i publiserte studier. Bisecting oocytter med den hensikt å fusjonere ooplastene med en somatisk celle er premisset for håndlaget kloning (HMC), som vanligvis bruker biseksjon som metode for å fjerne polarlegemet og metafaseplaten fra metafasen II (MII) oocytt. HMC har med hell produsert avkom i flere arter, inkludert geiter, storfe, griser, sauer og hester 22,23,24,25,26, men inkluderer vanligvis ikke et sentrifugeringstrinn før biseksjon. Integrering av høyhastighets sentrifugering av oocytten muliggjør isolering av mitokondrier (og derfor mtDNA) på en pol av oocytten, som deretter kan krysses ved hjelp av et mikroblad for å fjerne de mitokondri-tette fraksjonene. To mitokondrier-utarmede ooplaster kan deretter smeltes sammen med en somatisk celle, som det er tilfelle i HMC, for å danne et rekonstruert embryo som inneholder betydelig mindre mtDNA fra oocyttarter.

Spørsmålet vi prøver å svare på med denne protokollen er hvordan du kan redusere mtDNA i bovin oocytten for å produsere et levedyktig rekonstruert embryo som inneholder mindre heteroplasmatisk mtDNA. I denne protokollen ble oocytter sentrifugert og bisected. Ooplast og intakte oocytt mtDNA kopinumre ble beregnet for å bestemme effektiviteten av denne teknikken for å redusere bovint oocytes mtDNA kopinummer.

Protocol

Følgende protokoll følger retningslinjene for dyrepleie og etikk fra Utah State University. 1. Medieforberedelse Før oocytthåndtering, klargjør du følgende løsninger, som beskrevet i tabell 1: 400 μL hyaluronidaseløsning, 500 μL T2-medier, 1020 μL T20-medier og 800 μL T10-medier. Del T10-mediet i to brønner på en firebrønns plate, 400 μL per brønn. Merk en brønn med “M” og den andre brønnen med “MR.” Plasser i en 5% CO<su…

Representative Results

Kvantitative PCR-resultater (qPCR) brukes til å bestemme de relative mengdene mtDNA som finnes i hver ooplast. Den beskrevne reaksjonen er designet for å forsterke 12S-regionen av bovin mtDNA. Hvis biseksjonen var vellykket, vil prøvene fra hele oocytter og mitokondri-tette ooplaster ha lignende Ct-verdier . Prøvene fra mitokondriereduserende ooplaster vil ha høyere Ct-verdier sammenlignet med prøvene fra de to andre gruppene. En Ct-graf som viser vellykk…

Discussion

Metoder som tidligere ble brukt til å redusere mtDNA-kopinumre i oocytter, har sine respektive ulemper. Mikromanipuleringsbasert fjerning av mitokondrier fra oocytter reduserer mtDNA-kopieringsnumre med i gjennomsnitt 64%²⁷. En unik metode, tidligere brukt til enukleasjon, innebærer bruk av pasteurpipetter med liten diameter og splitting av en zona pellucidafri oocytt ved grensen mellom en mikrodråpe medier og den omkringliggende mineraloljen. Sammen med utnyttelsen av oocytt sentrifugering kan…

Materials

1.5 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	5408129
60 mm dish	Sigma-Aldrich	D8054
Centrifuge	Eppendorf	5424
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442
M199 Media	Sigma-Aldrich	M4530
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410
Mini Centrifuge	SCILOGEX	D1008
mtDNA Primer: Forward (12S)			GGGCTACATTCTCTACACCAAG
mtDNA Primer: Reverse (12S)			GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000
Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle	PFM Medical	207300633	Microblade for bisection
Protease/pronase	Sigma-Aldrich	P5147
QIAamp DNA Micro Kit	Qiagen	56304
QuantStudio™ 3 – 96-Well 0.2-mL	ThermoFisher	A28567
Search plate	Fisher Scientific	FB0875711A
SYBR Green qPCR Master Mix	ThermoFisher	K0221	qPCR master mix
Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF)
ThermoPlate	Tokai Hit	TPi-SMZSSX	Heating stage