كريسبر / كاس 9 التحرير الجيني للخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية لتطبيقات العلاج الجيني
Summary
يصف البروتوكول الحالي إجراء زراعة الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPC) الأمثل للتطعيم القوي للخلايا المحررة جينيا في الجسم الحي.
Abstract
كريسبر / كاس 9 هي أداة تحرير جينية متعددة الاستخدامات وفعالة للغاية تم اعتمادها على نطاق واسع لتصحيح الطفرات الجينية المختلفة. إن جدوى التلاعب الجيني للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) في المختبر تجعل HSPCs خلية مستهدفة مثالية للعلاج الجيني. ومع ذلك ، تفقد HSPCs بشكل معتدل قدرتها على إعادة التوطين وتعدد السلالات في الثقافة خارج الجسم الحي . في هذه الدراسة ، تم وصف ظروف الاستزراع المثالية التي تعمل على تحسين نقش HSPC وتوليد عدد متزايد من الخلايا المعدلة جينيا في الجسم الحي. يعرض التقرير الحالي ظروف الثقافة المحسنة في المختبر ، بما في ذلك نوع وسائط الاستزراع ، ومكملات كوكتيل الجزيئات الصغيرة الفريدة ، وتركيز السيتوكين ، وألواح زراعة الخلايا ، وكثافة الثقافة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير إجراء محسن لتحرير الجينات HSPC ، جنبا إلى جنب مع التحقق من صحة أحداث تحرير الجينات. للتحقق من الصحة في الجسم الحي ، يتم عرض تسريب HSPCs المحرر جينيا وتحليل ما بعد التطعيم في مستلمي الفئران. أظهرت النتائج أن نظام الاستزراع زاد من تواتر HSCs الوظيفية في المختبر ، مما أدى إلى نقش قوي للخلايا المحررة جينيا في الجسم الحي.
Introduction
إن عدم إمكانية الوصول إلى المتبرعين المطابقين لمستضد كريات الدم البيضاء البشرية (HLA) في أماكن زرع الخلايا الخيفية والتطور السريع لأدوات الهندسة الوراثية متعددة الاستخدامات والآمنة للغاية تجعل زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم الذاتية (HSCT) استراتيجية علاجية لاضطرابات الدم الوراثية 1,2. يتضمن العلاج الجيني الذاتي للخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية (HSPC) جمع HSPCs للمرضى ، والتلاعب الجيني ، وتصحيح الطفرات المسببة للأمراض ، وزرع HSPCs المصححة للجينات في المريض 3,4. ومع ذلك ، فإن النتيجة الناجحة للعلاج الجيني تعتمد على جودة الكسب غير المشروع المعدل جينيا القابل للزرع. تؤثر خطوات التلاعب الجيني والثقافة خارج الجسم الحي ل HSPCs على جودة الكسب غير المشروع عن طريق تقليل تواتر الخلايا الجذعية المكونة للدم على المدى الطويل (LT-HSCs) ، مما يستلزم ضخ جرعات كبيرة من HSPCsالتي يتم التلاعب بها جينيا 2،5،6.
يتم حاليا استخدام العديد من الجزيئات الصغيرة ، بما في ذلك SR1 و UM171 ، لتوسيع HSPCs من دم الحبل السري بقوة 7,8. بالنسبة ل HSPCs البالغة ، نظرا لارتفاع إنتاجية الخلايا التي تم الحصول عليها عند التعبئة ، فإن التوسع القوي غير مطلوب. ومع ذلك ، فإن الاحتفاظ بجذعية HSPCs المعزولة في الثقافة خارج الجسم الحي أمر بالغ الأهمية لتطبيقات العلاج الجيني. لذلك ، تم تطوير نهج يركز على إثراء زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) باستخدام مزيج من الجزيئات الصغيرة: ريسفيراترول ، UM729 ، و SR1 (RUS) 7. تعزز ظروف زراعة HSPC المحسنة إثراء HSCs ، مما يؤدي إلى زيادة تواتر HSCs المعدلة جينيا في الجسم الحي ، وتقلل من الحاجة إلى التلاعب الجيني بجرعات كبيرة من HSPCs ، مما يسهل مناهج العلاج الجيني الفعالة من حيث التكلفة8.
هنا ، يتم وصف بروتوكول شامل لثقافة HSPCs ، جنبا إلى جنب مع ضخ وتحليل الخلايا المحررة جينيا في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعتمد النتيجة الناجحة للعلاج الجيني HSPC في الغالب على جودة وكمية HSCs القابلة للنقش في الكسب غير المشروع. ومع ذلك ، تتأثر الخصائص الوظيفية ل HSCs بشكل كبير خلال المرحلة التحضيرية لمنتجات العلاج الجيني ، بما في ذلك عن طريق الثقافة في المختبر والسمية المرتبطة بإجراء التلاعب الجيني. للتغلب ع…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يريد المؤلفون الاعتراف بموظفي مرفق قياس التدفق الخلوي ومرفق الحيوانات في CSCR. يتم تمويل A. C. من خلال زمالة ICMR-SRF ، ويتم تمويل K. V. K. من خلال زمالة DST-INSPIRE ، ويتم تمويل P. B. من خلال زمالة CSIR-JRF. تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند (المنحة رقم BT / PR26901 / MED / 31/377/2017 و BT / PR31616 / MED / 31/408/2019)
Materials
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | – | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | – | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN – INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | – |
Referências
- Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443 (2019).
- Naldini, L. Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives. EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958 (2019).
- Srivastava, A., Shaji, R. V. Cure for thalassemia major – From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy. Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).
- Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies. Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253 (2020).
- Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment. Blood. 103 (2), 545-552 (2004).
- Piras, F., et al. Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells. EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).
- Christopher, A. C., et al. Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy. Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).
- Karuppusamy, K. V., et al. The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy. Frontiers in Immunology. 13, 792684 (2022).
- Hopman, R. K., DiPersio, J. F. Advances in stem cell mobilization. Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).
- Hoffman, T. L. Counting Cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 1, 21-24 (2006).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy. Stem Cell Research & Therapy. 12, 500 (2021).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Bagchi, A., et al. Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells. Cells. 10 (3), 1-18 (2021).
- Ravi, R., et al. Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin. eLife. 11, 65421 (2020).
- Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
- Leonard, A., et al. Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).
- Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice. Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).
- Audigé, A., et al. Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells. BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. Fc-receptors as regulators of immunity. Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Ngom, M., et al. UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).
- Park, Y. S., et al. Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules. Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214 (2022).
- Aiuti, A., et al. Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Rai, R., et al. Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing. bioRxiv. , (2022).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
