Verkrijging en decellularisatie van Rat Hindlimbs met behulp van een ex vivo perfusie-gebaseerde bioreactor voor gevasculariseerde composiet allotransplantatie
Summary
We beschrijven de chirurgische techniek en het decellularisatieproces voor samengestelde rattenachterpoten. Decellularisatie wordt uitgevoerd met behulp van natriumdodecylsulfaat met een lage concentratie via een ex vivo machineperfusiesysteem.
Abstract
Patiënten met ernstige traumatische verwondingen en weefselverlies vereisen een complexe chirurgische reconstructie. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is een evoluerende reconstructieve weg voor het overbrengen van meerdere weefsels als een samengestelde subeenheid. Ondanks het veelbelovende karakter van VCA, zijn de immunosuppressieve vereisten op lange termijn een significante beperking vanwege het verhoogde risico op maligniteiten, eindorgaantoxiciteit en opportunistische infecties. Tissue engineering van acellulaire composietsteigers is een potentieel alternatief om de behoefte aan immunosuppressie te verminderen. Hierin wordt de verkrijging van een rat hindlimb en de daaropvolgende decellularisatie met behulp van natriumdodecylsulfaat (SDS) beschreven. De gepresenteerde inkoopstrategie is gebaseerd op de gemeenschappelijke dijbeenslagader. Een machinaal perfusie-gebaseerd bioreactorsysteem werd gebouwd en gebruikt voor ex vivo decellularisatie van de achterste. Succesvolle perfusie decellularisatie werd uitgevoerd, resulterend in een wit doorschijnend-achtig uiterlijk van de achterste. Een intact, doorlaatbaar, vasculair netwerk in de hele achtervel werd waargenomen. Histologische analyses toonden de verwijdering van nucleaire inhoud en het behoud van weefselarchitectuur in alle weefselcompartimenten.
Introduction
VCA is een opkomende optie voor patiënten die een complexe chirurgische reconstructie nodig hebben. Traumatische verwondingen of tumorresecties resulteren in volumetrisch weefselverlies dat moeilijk te reconstrueren kan zijn. VCA biedt de transplantatie van meerdere weefsels zoals de huid, bot, spier, zenuwen en bloedvaten als een samengesteld transplantaat van een donor naar een ontvanger1. Ondanks het veelbelovende karakter is VCA beperkt vanwege langdurige immunosuppressieve regimes. Levenslang gebruik van dergelijke geneesmiddelen resulteert in een verhoogd risico op opportunistische infecties, maligniteiten en eindorgaantoxiciteit 1,2,3. Om de behoefte aan immunosuppressie te verminderen en / of te elimineren, zijn weefsel-gemanipuleerde steigers met behulp van decellularisatiebenaderingen voor VCA veelbelovend.
Weefseldecellularisatie houdt in dat de extracellulaire matrixstructuur behouden blijft terwijl de cellulaire en nucleaire inhoud wordt verwijderd. Deze gedecellulariseerde steiger kan opnieuw worden bevolkt met patiëntspecifieke cellen4. Het behoud van het ECM-netwerk van samengestelde weefsels is echter een extra uitdaging. Dit komt door de aanwezigheid van meerdere weefseltypen met verschillende weefseldichtheden, architecturen en anatomische locaties binnen een steiger. Het huidige protocol biedt een chirurgische techniek en een decellularisatiemethode voor een rat hindlimb. Dit is een proof-of-concept model voor het toepassen van deze tissue engineering techniek op composiet weefsels. Dit kan ook leiden tot latere inspanningen om samengestelde weefsels te regenereren door middel van recellularisatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rattenachterpoten zijn nuttig als experimentele modellen in VCA5. Tissue engineering van acellulaire steigers is de eerste stap in het aanpakken van de tekortkomingen van langdurige immunosuppressieregimes geassocieerd met VCA. Het gebruik van composiettransplantaten vormt een extra uitdaging gezien de aanwezigheid van meerdere weefsels, elk met unieke functionele, immunogene en structurele eigenschappen. Het huidige protocol toont een succesvolle methode voor het verkrijgen van acellulaire compos…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Figuur 3A is gemaakt in BioRender.com.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade – #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
Referências
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).
- Tao, M., et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal. Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).
- Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts. Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Cohen, S., et al. Generation of vascular chimerism within donor organs. Scientific Reports. 11 (1), 13437 (2021).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Urciuolo, A., et al. Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration. Scientific Reports. 8 (1), 8398 (2018).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
