الكشف عن المبيضات القابلة للنشر الميداني Liberibacter asiaticus باستخدام تضخيم بوليميراز Recombinase جنبا إلى جنب مع CRISPR-Cas12a
Summary
في هذا العمل ، تم تطوير طريقة كشف سريعة وحساسة ومحمولة ل Candidatus Liberibacter asiaticus على أساس تضخيم بوليميراز recombinase جنبا إلى جنب مع CRISPR-Cas12a.
Abstract
يسهل الكشف المبكر عن Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) من قبل مزارعي الحمضيات التدخل المبكر ويمنع انتشار المرض. يتم تقديم طريقة بسيطة لتشخيص Huanglongbing (HLB) السريع والمحمول هنا والتي تجمع بين تضخيم بوليميراز recombinase ومراسل الفلورسنت باستخدام نشاط النيوكلياز لنظام التكرارات القصيرة المتباعدة بانتظام / 12a المرتبط ب CRISPR (CRISPR-Cas12a). حساسية هذه التقنية أعلى بكثير من PCR. علاوة على ذلك ، أظهرت هذه الطريقة نتائج مماثلة ل qPCR عند استخدام عينات الأوراق. بالمقارنة مع طرق الكشف عن CLas التقليدية ، يمكن إكمال طريقة الكشف المعروضة هنا في 90 دقيقة وتعمل في حالة متساوية الحرارة لا تتطلب استخدام أجهزة PCR. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصور النتائج من خلال جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول في الميدان.
Introduction
Huanglongbing (HLB) هي واحدة من أكثر أمراض الحمضيات إشكالية في جميع أنحاء العالم1. يحدث HLB بسبب البكتيريا المستعمرة لللحاء والحساسية Candidatus Liberibacter spp. ، بما في ذلك Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) و Ca. L. africanus و Ca. L. americanus2. أكثر الأنواع المرتبطة ب HLB انتشارا في الصين والولايات المتحدة الأمريكية هي CLas ، والتي تنتقل عن طريق سيلليدات الحمضيات الآسيوية (Diaphorina citri) أو من خلال التطعيم3. بعد الإصابة ب CLas ، تظهر أشجار الحمضيات انخفاضا في النمو حتى الموت2. الأعراض الشائعة لأوراق الحمضيات المصابة ب CLas هي بقع مرقطة ، وجزر خضراء (نقاط خضراء داكنة دائرية صغيرة) ، وعروق فلينية مرتفعة على أوراق سميكة وجلدية ، وبراعم اصفرار غير منتظمة2. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر الثمار المصابة ب CLas صغيرة وغير متوازنة2.
نظرا لعدم وجود نوع من الحمضيات مقاوم ل HLB ولا يوجد علاج علاجي ل HLB ، فإن الوقاية من HLB تتطلب الحجر الصحي وعزل أشجار الحمضيات الإيجابيةCLas 2,3. لذلك ، يعد الاكتشاف المبكر أمرا بالغ الأهمية للمراقبة والحجر الصحي لمنع انتشار CLas وتقليل الخسائر الاقتصادية3. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى اكتشاف CLas الحساس بسبب انخفاض عيار CLas في النباتات خلال المرحلة المبكرة من العدوى3. في الصين ، عادة ما يتم إجراء اكتشاف CLas بواسطة بعض مراكز الاختبار المعتمدة. ومع ذلك ، فإن عملية الكشف عادة ما تستغرق ما لا يقل عن 1 أسبوع ، ورسوم الكشف باهظة الثمن. لذلك ، للمساعدة في مراقبة حدوث HLB
تم تطبيق تقنيات مختلفة لتشخيص HLB4،5،6،7،8،9. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) و PCR الكمي (qPCR) هما الأداتان الأكثر استخداما للكشف عن CLas نظرا لحساسيتهما العالية ونوعيتهما 4,5. غير أن هذه التكنولوجيات تعتمد اعتمادا كبيرا على أدوات باهظة الثمن وموظفين ذوي مهارات عالية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير العديد من طرق التضخيم متساوي الحرارة ، مثل التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) ، كبدائل جذابة لطرق تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية نظرا لبساطتها وسرعتها وتكلفتها المنخفضة8،9،10. ومع ذلك ، من الصعب تطبيقها للكشف بدقة عن CLas بسبب إشارات التضخيم غير المحددة ، والتي قد تسبب نتائج إيجابية خاطئة.
تم تطوير الكشف عن الحمض النووي النووي القائم على نوكلياز الداخلية الموجه بالحمض النووي الريبي (مجمعة بشكل منتظم بين التكرارات القصيرة المتباعدة / المرتبطة بكريسبر) كتقنية تشخيص جزيئي من الجيل التالي نظرا لحساسيتها العالية وخصوصيتها وموثوقيتها11،12،13،14. تعتمد تقنيات تشخيص CRISPR / Cas هذه على نشاط النيوكلياز الجانبي لبروتينات Cas لشق الحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA) المعدل باستخدام مراسل فلوري ومطفأ مضان في كل طرف من أطراف قليل النيوكليوتيدات ، بالإضافة إلى جهاز الكشف عن التألق لالتقاط المراسل الفلوري الذي تم إصداره11,12 . يمكن أن يؤدي نشاط النيوكلياز للعديد من مستجيبات Cas التي يتم تنشيطها بواسطة الازدواج المستهدف CRISPR RNA (crRNA) إلى شق ssDNA11 المحيط غير المستهدف بشكل عشوائي. يوضح CRISPR-Cas12a (ويسمى أيضا Cpf 1) ، وهو نظام V-A CRISPR / CAS من الفئة 2 ، العديد من المزايا مقارنة ب Cas9 ، مثل انخفاض تحمل عدم التطابق وخصوصية أكبر13. تم تطبيق نظام Cas12a / crRNA للكشف الحساس والمحدد للأحماض النووية لمسببات الأمراض البشرية ومسببات الأمراض النباتية14،15،16،17،18. لذلك ، فإن استخدام نظام Cas12a / crRNA يجب أن يتيح الكشف الدقيق والحساس للحمض النووي ل CLas.
Cas12a وحده ليس حساسا من الناحية النظرية بما يكفي للكشف عن مستويات منخفضة من الأحماض النووية. لذلك ، لتحسين حساسية الكشف ، يتم عادة دمج اكتشاف CRISPR-Cas12a مع خطوة تضخيم متساوي الحرارة14,15. يتيح تضخيم البوليميراز المعاد تجميعه (RPA) تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة الحساس والسريع في نطاق درجة حرارة من 37 درجة مئوية إلى 42 درجة مئوية19.
تم مؤخرا ابتكار منصة كشف تسمى DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) التي تجمع بين نشاط DNase ل Cas12a و RPA وقراءة مضان12 وقد ثبت أنها تكتشف الحمض النووي بحساسية أعلى20. علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة إشارة التألق المنبعثة من العينات الإيجابية من خلال جهاز كشف مضان محمول باليد في الميدان.
نظرا لأننا قمنا بتضخيم الحمض النووي باستخدام RPA ، وصممنا crRNA الذي يستهدف الجين المكون من خمس نسخ nrdB (اختزال الريبونوكليوتيد β الوحدة الفرعية) الخاص ب CLas21 ، واستخدمنا نشاط DNase لبروتين Cas12a ، أطلقنا على طريقة الكشف عن CLas هذه CLas-DETECTR. بالمقارنة مع طرق الكشف عن CLas الحالية ، فإن CLas-DETECTR سريع ودقيق وحساس وقابل للنشر.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الدراسة طريقة سريعة ومحمولة للكشف عن CLas تسمى CLas-DETECTR ، والتي تجمع بين أنظمة RPA و CRISPR-Cas12a. يوضح الشكل 1 سير العمل. يكتشف CLas-DETECTR CLas بخصوصية وحساسية (الشكل 2 والشكل 3). علاوة على ذلك ، باستخدام عينات أوراق نيوهول ، يكتشف CLas-DETECTR CLas ب…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل ماليا من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFD1400805) ، وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا في مقاطعة جيانغشي (20194ABC28007) ، ومشاريع إدارة التعليم في جيانغشي (GJJ201449) ، والابتكار التعاوني للبحث العلمي الزراعي الحديث في مقاطعة جيانغشي (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
Materials
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China | |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China | |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China | |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China | |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China | |
| Hole puncher | Deli | 114 | China | |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK | |
| NaOH | SCR | 10019718 | China | |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA | |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China | |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA | |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China | |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China | |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
Referências
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
- Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
- Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
- Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
- Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
- Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
- Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’ in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
- Chertow, D. S. Next-generation diagnostics with CRISPR. Science. 360 (6387), 381-382 (2018).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
- Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
- Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
- Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
- Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
- Lobato, I. M., O’Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
- Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
- Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
- Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
- Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
- Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
- Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen (‘Candidatus Liberibacter asiaticus’) using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).
