In dit werk werd een snelle, gevoelige en draagbare detectiemethode voor Candidatus Liberibacter asiaticus ontwikkeld op basis van recombinasepolymeraseversterking in combinatie met CRISPR-Cas12a.
De vroege detectie van Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) door citrustelers vergemakkelijkt vroegtijdige interventie en voorkomt de verspreiding van ziekten. Een eenvoudige methode voor snelle en draagbare Huanglongbing (HLB) diagnose wordt hier gepresenteerd die recombinase polymerase amplificatie en een fluorescerende reporter combineert met behulp van de nuclease-activiteit van het geclusterde regelmatig tussen elkaar geplaatste korte palindromische repeats / CRISPR-geassocieerde 12a (CRISPR-Cas12a) systeem. De gevoeligheid van deze techniek is veel hoger dan PCR. Bovendien vertoonde deze methode vergelijkbare resultaten als qPCR wanneer bladmonsters werden gebruikt. In vergelijking met conventionele CLas-detectiemethoden kan de hier gepresenteerde detectiemethode in 90 minuten worden voltooid en werkt deze in een isothermische toestand waarvoor geen PCR-machines nodig zijn. Bovendien kunnen de resultaten worden gevisualiseerd via een handheld fluorescerend detectieapparaat in het veld.
Huanglongbing (HLB) is een van de meest problematische citrusziekten wereldwijd1. HLB wordt veroorzaakt door de floëem-koloniserende en kieskeurige bacterie Candidatus Liberibacter spp., waaronder Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus en Ca. L. americanus2. De meest voorkomende HLB-geassocieerde soort in China en de VS is CLas, die wordt overgedragen door Aziatische citrus psylliden (Diaphorina citri) of door enten3. Na besmetting met CLas vertonen citrusbomen groeidaling tot de dood2. De meest voorkomende symptomen van citrusbladeren die besmet zijn met CLas zijn vlekkerige, groene eilanden (kleine cirkelvormige donkergroene stippen), verhoogde kurkachtige nerven op dikkere en leerachtige bladeren en niet-uniforme vergeelde scheuten2. Bovendien lijken vruchten die zijn geïnfecteerd met CLas klein en scheef2.
Aangezien geen enkel citrusras resistent is tegen HLB en er geen therapeutische remedie voor HLB is, vereist de preventie van HLB de quarantaine en isolatie van CLas-positieve citrusbomen 2,3. Daarom is vroege detectie van cruciaal belang voor monitoring en quarantaine om de verspreiding van LAS’s te voorkomen en economische verliezen te minimaliseren3. Bovendien is gevoelige CLas-detectie nodig vanwege de lage titer van CLas in planten tijdens het vroege stadium van infectie3. In China wordt CLas-detectie meestal uitgevoerd door bepaalde gecertificeerde testcentra. Het detectieproces duurt echter meestal minstens 1 week en de detectiekosten zijn duur. Daarom, om de HLB-incidentie te helpen monitoren
Verschillende technologieën zijn toegepast om HLB 4,5,6,7,8,9 te diagnosticeren. Polymerasekettingreactie (PCR) en kwantitatieve PCR (qPCR) zijn de meest gebruikte hulpmiddelen voor CLas-detectie vanwege hun hoge gevoeligheid en specificiteit 4,5. Die technologieën zijn echter sterk afhankelijk van dure instrumenten en hoogopgeleid personeel. Daarnaast zijn verschillende isothermische amplificatiemethoden, zoals lusgemedieerde isothermische amplificatie (LAMP), ontwikkeld als aantrekkelijke alternatieven voor conventionele PCR-methoden vanwege hun eenvoud, snelheid en lage kosten 8,9,10. Het is echter een uitdaging om ze toe te passen om CLas nauwkeurig te detecteren vanwege de niet-specifieke versterkingssignalen, die vals-positieve resultaten kunnen veroorzaken.
RNA-geleide CRISPR/Cas (geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen/CRISPR-geassocieerde) endonuclease-gebaseerde nucleïnezuurdetectie is ontwikkeld als een moleculaire diagnostiektechnologie van de volgende generatie vanwege de hoge gevoeligheid, specificiteit en betrouwbaarheid 11,12,13,14. Deze CRISPR/Cas-diagnosetechnologieën vertrouwen op de collaterale nuclease-activiteit van Cas-eiwitten om enkelstrengs DNA (ssDNA) te splitsen dat is gemodificeerd met een fluorescerende reporter en een fluorescentieblusmeter aan elk uiteinde van de oligonucleotiden, evenals een fluorescentiedetectieapparaat om de vrijgegeven fluorescerende reporter11,12 vast te leggen . De nuclease-activiteit van verschillende Cas-effectoren die worden geactiveerd door de CRISPR-RNA (crRNA) doel duplex kan zonder onderscheid de omringende niet-doel ssDNA11 splitsen. CRISPR-Cas12a (ook wel Cpf 1 genoemd), een klasse 2 type V-A CRISPR/Cas systeem, toont verschillende voordelen ten opzichte van Cas9, zoals een lagere mismatch tolerantie en grotere specificiteit13. Het Cas12a/crRNA-systeem is toegepast voor de gevoelige en specifieke detectie van de nucleïnezuren van menselijke pathogenen en fytopathogenen 14,15,16,17,18. Daarom moet het gebruik van het Cas12a/crRNA-systeem de nauwkeurige en gevoelige detectie van het nucleïnezuur van CLas mogelijk maken.
Cas12a alleen is theoretisch niet gevoelig genoeg om lage niveaus van nucleïnezuren te detecteren. Om de detectiegevoeligheid te verbeteren, wordt CRISPR-Cas12a-detectie daarom meestal gecombineerd met een isothermische versterkingsstap14,15. Recombinasepolymerase-amplificatie (RPA) maakt gevoelige en snelle isothermische DNA-amplificatie mogelijk in een temperatuurbereik van 37 °C tot 42 °C19.
Een detectieplatform genaamd DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) dat de DNase-activiteit van Cas12a combineert met RPA en een fluorescentie-uitlezing is onlangs bedacht12 en er is aangetoond dat het nucleïnezuur detecteert met een hogere gevoeligheid20. Bovendien kan het fluorescentiesignaal dat door de positieve monsters wordt uitgezonden, worden waargenomen via een handheld fluorescentiedetectieapparaat in het veld.
Omdat we DNA hebben versterkt met RPA, crRNA hebben ontworpen gericht op het vijfkopie nrdB-gen (ribonucleotide reductase β-subunit) dat specifiek is voor CLas21 en de DNase-activiteit van het Cas12a-eiwit hebben gebruikt, hebben we deze CLas-detectiemethode CLas-DETECTR genoemd. In vergelijking met bestaande CLas-detectiemethoden is CLas-DETECTR snel, nauwkeurig, gevoelig en inzetbaar.
Deze studie presenteert een snelle en draagbare methode om CLas-DETECTR genaamd te detecteren, die de RPA- en CRISPR-Cas12a-systemen combineert. De workflow wordt geïllustreerd in figuur 1. CLas-DETECTR detecteert CLas met specificiteit en gevoeligheid (figuur 2 pt figuur 3). Bovendien detecteert CLas-DETECTR met behulp van Newhall-bladmonsters CLas met dezelfde gevoeligheid als qPCR (figuur 4<…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd financieel ondersteund door het National Key R &D-programma van China (2021YFD1400805), het Major Science and Technology R &D-programma van de provincie Jiangxi (20194ABC28007), projecten van het Jiangxi Education Department (GJJ201449) en de Collaborative Innovation of Modern Agricultural Scientific Research in de provincie Jiangxi (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China | |
Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China | |
EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China | |
Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China | |
Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China | |
Hole puncher | Deli | 114 | China | |
Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK | |
NaOH | SCR | 10019718 | China | |
NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA | |
PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China | |
PEG 200 | Sigma | P3015 | USA | |
PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China | |
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA | |
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China | |
TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |