זיהוי קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס הניתן לפריסה בשטח באמצעות הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a
Summary
בעבודה זו פותחה שיטת זיהוי מהירה, רגישה וניידת עבור Candidatus Liberibacter asiaticus המבוססת על הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a.
Abstract
הגילוי המוקדם של קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס (CLas) על ידי מגדלי הדרים מקל על התערבות מוקדמת ומונע את התפשטות המחלה. כאן מוצגת שיטה פשוטה לאבחון מהיר ונייד של הואנגלונגבינג (HLB) המשלבת הגברה של רקומבינאז פולימראז וכתב פלואורסצנטי המנצל את פעילות הנוקלאז של מערכת החזרות הפלינדרומיות הקצרות המקובצים באופן קבוע/מערכת 12a (CRISPR-Cas12a) הקשורה לקריספר. הרגישות של טכניקה זו היא הרבה יותר גבוהה מאשר PCR. יתר על כן, שיטה זו הראתה תוצאות דומות ל- qPCR כאשר נעשה שימוש בדגימות עלים. בהשוואה לשיטות גילוי CLas קונבנציונליות, ניתן להשלים את שיטת האיתור המוצגת כאן תוך 90 דקות ועובדת במצב איזותרמי שאינו דורש שימוש במכונות PCR. בנוסף, ניתן להמחיש את התוצאות באמצעות מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני בשטח.
Introduction
הואנגלונגבינג (HLB) היא אחת ממחלות ההדרים הבעייתיות ביותר בעולם1. HLB נגרם על-ידי החיידק המתיישב והמחזק של פלום קנדידטוס ליבריבקטר spp., כולל קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס (CLas), Ca. L. africanus, ו– Ca. L. americanus2. המין הנפוץ ביותר הקשור ל-HLB בסין ובארה”ב הוא CLas, המועבר על ידי פסילידים של הדרים אסייתיים (Diaphorina citri) או באמצעות השתלה3. לאחר שנדבקו ב-CLas, עצי הדר מפגינים ירידה בגדילה עד מוות2. התסמינים השכיחים של עלי הדר הנגועים ב-CLas הם כתמים עזים, איים ירוקים (נקודות ירוקות כהות עגולות קטנות), ורידים מורמים על עלים עבים ועוריים יותר, ויורה מצהיבים לא אחידים2. בנוסף, פירות נגועים CLas נראים קטנים lopsided2.
מכיוון שאף זן הדרים אינו עמיד בפני HLB ואין תרופה טיפולית ל-HLB, מניעת HLB דורשת הסגר ובידוד של עצי הדר חיוביים ל-CLas 2,3. לכן, גילוי מוקדם הוא קריטי לניטור והסגר כדי למנוע את התפשטות CLas ולמזער הפסדים כלכליים3. בנוסף, יש צורך בזיהוי CLas רגיש בשל טיטר נמוך של CLas בצמחים בשלב המוקדם של ההדבקה3. בסין, זיהוי CLas מתבצע בדרך כלל על ידי מרכזי בדיקה מוסמכים מסוימים. עם זאת, תהליך האיתור אורך בדרך כלל לפחות שבוע אחד, ודמי האיתור יקרים. לכן, כדי לסייע במעקב אחר שכיחות ה-HLB
טכנולוגיות שונות יושמו כדי לאבחן HLB 4,5,6,7,8,9. תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ו-PCR כמותי (qPCR) הם הכלים הנפוצים ביותר לזיהוי CLas בשל הרגישות והספציפיות הגבוהה שלהם 4,5. עם זאת, טכנולוגיות אלה מסתמכות במידה רבה על מכשירים יקרים וכוח אדם מיומן ביותר. בנוסף, מספר שיטות הגברה איזותרמיות, כגון הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP), פותחו כחלופות אטרקטיביות לשיטות PCR קונבנציונליות בשל פשטותן, מהירותן ועלותן הנמוכה 8,9,10. עם זאת, מאתגר ליישם אותם כדי לזהות במדויק CLas בשל אותות ההגברה הלא ספציפיים, שעלולים לגרום לתוצאות חיוביות שגויות.
קריספר/Cas מונחה RNA (אשכולות קבועים בין פלינדרומיים קצרים חוזרים / הקשורים לקריספר) זיהוי חומצות גרעין מבוססות אנדונוקלאז פותח כטכנולוגיית אבחון מולקולרית מהדור הבא הודות לרגישות, הספציפיות והאמינות הגבוהה שלה 11,12,13,14. טכנולוגיות אבחון אלה של CRISPR/Cas מסתמכות על פעילות הנוקלאז הבטוחה של חלבוני Cas כדי לבקע דנ”א חד-גדילי (ssDNA) ששונה באמצעות כתב פלואורסצנטי ומתקן פלואורסצנטי בכל קצה של האוליגונוקלאוטידים, כמו גם מכשיר לזיהוי פלואורסצנטי כדי ללכוד את המדווח הפלואורסצנטיהמשוחרר 11,12 . פעילות הנוקלאז של מספר אפקטים של Cas המופעלים על-ידי דופלקס המטרה של CRISPR RNA (crRNA) יכולה לבקע ללא הבחנה את ה-ssDNA11 שאינו מטרה. CRISPR-Cas12a (נקרא גם Cpf 1), מערכת V-A CRISPR/CAS מסוג 2, מדגים מספר יתרונות בהשוואה ל-Cas9, כגון סובלנות נמוכה יותר לאי-התאמה וספציפיות גבוהה יותר13. מערכת Cas12a/crRNA יושמה לזיהוי רגיש וספציפי של חומצות גרעין של פתוגנים אנושיים ופיטופתוגנים 14,15,16,17,18. לכן, שימוש במערכת Cas12a/crRNA אמור לאפשר זיהוי מדויק ורגיש של חומצת הגרעין של CLas.
Cas12a לבדו אינו רגיש מספיק מבחינה תיאורטית כדי לזהות רמות נמוכות של חומצות גרעין. לכן, כדי לשפר את רגישות הגילוי שלו, זיהוי CRISPR-Cas12a משולב בדרך כלל עם שלב הגברה איזותרמי14,15. הגברת רקומבינאז פולימראז (RPA) מאפשרת הגברה של DNA איזותרמי רגיש ומהיר בטווח טמפרטורות שבין 37 °C ל-42 °C19.
פלטפורמת זיהוי בשם DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) המשלבת את פעילות ה- DNase של Cas12a עם RPA וקריאת פלואורסצנציה פותחהלאחרונה 12 והוכחה כמזהה חומצת גרעין עם רגישות גבוהה יותר20. יתר על כן, ניתן לצפות באות הפלואורסצנטי הנפלט מהדגימות החיוביות באמצעות מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני בשטח.
מאחר שהגברנו את הדנ”א באמצעות RPA, תכננו crRNA המכוון לגן nrdB בעל חמישה עותקים (ריבונוקלאוטיד רדוקטאז β– תת-יחידה) הספציפי ל-CLas21, והשתמשנו בפעילות ה-DNase של חלבון Cas12a, קראנו לשיטת זיהוי CLas זו CLas-DETECTR. בהשוואה לשיטות זיהוי CLas קיימות, CLas-DETECTR הוא מהיר, מדויק, רגיש וניתן לפריסה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה מציג שיטה מהירה וניידת לזיהוי CLas בשם CLas-DETECTR, המשלבת את מערכות ה-RPA וה-CRISPR-Cas12a. זרימת העבודה מודגמת באיור 1. CLas-DETECTR מזהה CLas עם ספציפיות ורגישות (איור 2 ואיור 3). יתר על כן, באמצעות דגימות עלים של Newhall, CLas-DETECTR מזהה CLas באותה רגישות כמ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה כספית על ידי תוכנית R & D המפתח הלאומית של סין (2021YFD1400805), תוכנית המדע והטכנולוגיה הגדולה R&D של מחוז ג’יאנגשי (20194ABC28007), פרויקטים של מחלקת החינוך של ג’יאנגשי (GJJ201449), והחדשנות השיתופית של המחקר המדעי החקלאי המודרני במחוז ג’יאנגשי (JXXTCX2015002(3+2)-003).
Materials
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China | |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China | |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China | |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China | |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China | |
| Hole puncher | Deli | 114 | China | |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK | |
| NaOH | SCR | 10019718 | China | |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA | |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China | |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA | |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China | |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China | |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
Referências
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
- Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
- Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
- Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
- Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
- Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
- Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’ in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
- Chertow, D. S. Next-generation diagnostics with CRISPR. Science. 360 (6387), 381-382 (2018).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
- Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
- Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
- Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
- Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
- Lobato, I. M., O’Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
- Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
- Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
- Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
- Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
- Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
- Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen (‘Candidatus Liberibacter asiaticus’) using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).
