CRISPR-Cas12aと組み合わせたリコンビナーゼポリメラーゼ増幅を用いたフィールド展開可能な カンディダトゥス ・リベリバクター・アジアティカス検出(英語)
Summary
本研究では、CRISPR-Cas12aと組み合わせたリコンビナーゼポリメラーゼ増幅に基づくカン ディダトゥス ・リベリバクター・アジアティカスの迅速、高感度、かつポータブルな検出法を開発しました。
Abstract
柑橘類栽培者による カンジダトゥス ・リベリバクター・アジアティカス(CLas)の早期発見は、早期介入を促進し、病気の蔓延を防ぎます。ここでは、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅と、クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復/CRISPR関連12a(CRISPR-Cas12a)システムのヌクレアーゼ活性を利用した蛍光レポーターを組み合わせた、迅速でポータブルな黄龍峰(HLB)診断のための簡単な方法を紹介します。この技術の感度はPCRよりもはるかに高いです。さらに、この方法は、葉サンプルを使用した場合のqPCRと同様の結果を示しました。従来のCLas検出法と比較して、ここで紹介した検出方法は90分で完了し、PCR装置を使用する必要のない等温条件で動作します。さらに、結果は現場でハンドヘルド蛍光検出装置を介して視覚化することができます。
Introduction
黄龍峰(HLB)は、世界で最も問題のある柑橘類の病気の1つです1。HLBは、師部コロニー形成および潔癖性細菌カン ディダトゥ ス・リベリバクター属( Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)、 Ca. L. africanus、 Ca. L. americanus2を含む。中国と米国で最も一般的なHLB関連種はCLasであり、これはアジアの柑橘類のオオバコ(Diaphorina citri)または接ぎ木によって伝染します3。CLasに感染した後、柑橘類の木は死ぬまで成長の低下を示します2。CLasに感染した柑橘類の葉の一般的な症状は、しみのあるまだら、緑色の島(小さな円形の濃い緑色の点)、厚くて革のような葉の隆起したコルク状の静脈、および不均一な黄変芽です2。さらに、CLasに感染した果物は小さくて偏っているように見えます2。
HLBに耐性のある柑橘類の品種はなく、HLBの治療法もないため、HLBの予防にはCLas陽性の柑橘類の木の検疫と分離が必要です2,3。したがって、CLasの蔓延を防ぎ、経済的損失を最小限に抑えるための監視と検疫には、早期発見が重要です3。さらに、感染初期の植物ではCLasの力価が低いため、高感度のCLas検出が必要です3。中国では、CLas検出は通常、特定の認定テストセンターによって実施されます。ただし、検出プロセスには通常少なくとも1週間かかり、検出料金は高額です。したがって、HLB発生率の監視を支援するために
HLB 4,5,6,7,8,9を診断するために様々な技術が適用されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)と定量PCR(qPCR)は、その高い感度と特異性により、CLas検出に最もよく使用されるツールです4,5。ただし、これらのテクノロジーは、高価な機器と高度なスキルを持つ人材に大きく依存しています。さらに、ループ媒介等温増幅(LAMP)などのいくつかの等温増幅法は、その単純さ、迅速性、および低コストのために、従来のPCR法の魅力的な代替手段として開発されています8,9,10。しかし、非特異的な増幅シグナルによりCLasを正確に検出するためにそれらを適用することは困難であり、偽陽性の結果を引き起こす可能性があります。
RNAガイド下CRISPR/Cas(クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復/CRISPR関連)エンドヌクレアーゼベースの核酸検出は、その高い感度、特異性、および信頼性により、次世代の分子診断技術として開発されました11,12,13,14。これらのCRISPR/Cas診断技術は、Casタンパク質の側副ヌクレアーゼ活性に依存して、オリゴヌクレオチドの両端にある蛍光レポーターと蛍光消光物質で修飾された一本鎖DNA(ssDNA)を切断し、放出された蛍光レポーターを捕捉する蛍光検出装置を備えています11,12。.CRISPR RNA(crRNA)標的二重鎖によって活性化されるいくつかのCasエフェクターのヌクレアーゼ活性は、周囲の非標的ssDNAを無差別に切断することができる11。クラス2型V-A CRISPR/CasシステムであるCRISPR-Cas12a(Cpf 1とも呼ばれる)は、Cas9と比較して、ミスマッチ耐性が低く、特異性が高いなど、いくつかの利点を示しています13。Cas12a/crRNAシステムは、ヒト病原体および植物病原体の核酸の高感度かつ特異的な検出に適用されています14,15,16,17,18。したがって、Cas12a/crRNAシステムを利用することで、CLasの核酸を正確かつ高感度に検出できるはずです。
Cas12a単独では、低レベルの核酸を検出するのに十分な感度は理論的にありません。したがって、その検出感度を向上させるために、CRISPR−Cas12a検出は、典型的には等温増幅ステップ14、15と組み合わされる。リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)は、37°Cから42°Cの温度範囲で高感度かつ迅速な等温DNA増幅を可能にします19。
Cas12aのDNase活性とRPAおよび蛍光読み出しを組み合わせたDETECTR(DNAエンドヌクレアーゼ標的CRISPR トランス レポーター)と呼ばれる検出プラットフォームが最近考案され12 、より高感度で核酸を検出することが示されています20。さらに、陽性サンプルから放出された蛍光シグナルは、現場でハンドヘルド蛍光検出装置を介して観察することができる。
RPAでDNAを増幅し、CLas21に特異的な5コピーnrdB(リボヌクレオチド還元酵素β-サブユニット)遺伝子を標的とするcrRNAを設計し、Cas12aタンパク質のDNase活性を利用したことから、このCLas検出法をCLas-DETECTRと名付けました。既存のCLas検出方法と比較して、CLas-DETECTRは高速、正確、高感度、および展開可能です。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、RPAシステムとCRISPR-Cas12aシステムを組み合わせたCLas-DETECTRと名付けられたCLasを検出するための迅速でポータブルな方法を提示します。このワークフローを図 1 に示します。CLas-DETECTRは、特異性と感度でCLasを検出します(図2および図3)。さらに、ニューホールの葉サンプルを用いて、CLas-DETECTRはqPCRと同…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、中国の国家重点研究開発プログラム(2021YFD1400805)、江西省の主要科学技術研究開発プログラム(20194ABC28007)、江西省教育局のプロジェクト(GJJ201449)、および江西省における現代農業科学研究の共同イノベーション(JXXTCX2015002(3+2)-003)によって財政的に支援されました。
Materials
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China | |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China | |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China | |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China | |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China | |
| Hole puncher | Deli | 114 | China | |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK | |
| NaOH | SCR | 10019718 | China | |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA | |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China | |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA | |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China | |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China | |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
Referências
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