Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus desplegable en campo mediante amplificación de polimerasa recombinasa combinada con CRISPR-Cas12a
Summary
En este trabajo, se desarrolló un método de detección rápido, sensible y portátil para Candidatus Liberibacter asiaticus basado en la amplificación de la polimerasa recombinasa combinada con CRISPR-Cas12a.
Abstract
La detección temprana de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) por los productores de cítricos facilita la intervención temprana y previene la propagación de la enfermedad. Aquí se presenta un método simple para el diagnóstico rápido y portátil de Huanglongbing (HLB) que combina la amplificación de la polimerasa recombinasa y un reportero fluorescente que utiliza la actividad nucleasa del sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas / 12a asociado a CRISPR (CRISPR-Cas12a). La sensibilidad de esta técnica es mucho mayor que la PCR. Además, este método mostró resultados similares a la qPCR cuando se utilizaron muestras de hojas. En comparación con los métodos de detección de CLas convencionales, el método de detección presentado aquí se puede completar en 90 minutos y funciona en una condición isotérmica que no requiere el uso de máquinas de PCR. Además, los resultados se pueden visualizar a través de un dispositivo de detección fluorescente portátil en el campo.
Introduction
Huanglongbing (HLB) es una de las enfermedades de los cítricos más problemáticas en todo el mundo1. El HLB es causado por la bacteria colonizadora de floemas y fastidiosa Candidatus Liberibacter spp., incluyendo Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus y Ca. L. americanus2 . La especie asociada al HLB más prevalente en China y los EE.UU. es CLas, que se transmite por psílidos asiáticos de los cítricos (Diaphorina citri) o a través de injertos3. Después de ser infectados por CLas, los árboles de cítricos muestran una disminución del crecimiento hasta la muerte2. Los síntomas comunes de las hojas de cítricos infectadas con CLas son moteado con manchas, islas verdes (pequeños puntos circulares de color verde oscuro), venas corchosas elevadas en hojas más gruesas y coriáceas, y brotes amarillentos no uniformes2. Además, las frutas infectadas con CLas aparecen pequeñas y desequilibradas2.
Dado que ninguna variedad de cítricos es resistente al HLB y no existe cura terapéutica para el HLB, la prevención del HLB requiere la cuarentena y el aislamiento de los cítricos CLas-positivos 2,3. Por lo tanto, la detección temprana es crítica para el monitoreo y la cuarentena para prevenir la propagación de CLas y minimizar las pérdidas económicas3. Además, se necesita la detección sensible de CLas debido al bajo título de CLas en las plantas durante la etapa temprana de la infección3. En China, la detección de CLas generalmente es realizada por ciertos centros de prueba certificados. Sin embargo, el proceso de detección generalmente toma al menos 1 semana, y la tarifa de detección es costosa. Por lo tanto, para ayudar a monitorear la incidencia de HLB
Se han aplicado diversas tecnologías para diagnosticar HLB 4,5,6,7,8,9. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR cuantitativa (qPCR) son las herramientas más utilizadas para la detección de CLas debido a su alta sensibilidad y especificidad 4,5. Sin embargo, esas tecnologías dependen en gran medida de instrumentos costosos y personal altamente calificado. Además, varios métodos de amplificación isotérmica, como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), han sido desarrollados como alternativas atractivas a los métodos convencionales de PCR debido a su simplicidad, rapidez y bajo costo 8,9,10. Sin embargo, es difícil aplicarlos para detectar con precisión CLas debido a las señales de amplificación no específicas, que pueden causar resultados falsos positivos.
La detección de ácidos nucleicos basada en endonucleasa basada en CRISPR/Cas (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas regularmente / asociadas a CRISPR) se ha desarrollado como una tecnología de diagnóstico molecular de próxima generación debido a su alta sensibilidad, especificidad y confiabilidad11,12,13,14. Estas tecnologías de diagnóstico CRISPR/Cas se basan en la actividad nucleasa colateral de las proteínas Cas para escindir ADN monocatenario (ssDNA) modificado con un reportero fluorescente y un extintor de fluorescencia en cada extremo de los oligonucleótidos, así como un dispositivo de detección de fluorescencia para capturar el reportero fluorescente liberado11,12 . La actividad nucleasa de varios efectores Cas activados por el dúplex diana de ARN CRISPR (crRNA) puede escindir indiscriminadamente el ssDNA11 circundante no diana. CRISPR-Cas12a (también llamado Cpf 1), un sistema CRISPR/Cas de clase 2 tipo V-A, demuestra varias ventajas en comparación con Cas9, como una menor tolerancia al desajuste y una mayor especificidad13. El sistema Cas12a/crRNA ha sido aplicado para la detección sensible y específica de los ácidos nucleicos de patógenos humanos y fitopatógenos 14,15,16,17,18. Por lo tanto, la utilización del sistema Cas12a / crRNA debería permitir la detección precisa y sensible del ácido nucleico de CLas.
Cas12a solo no es teóricamente lo suficientemente sensible como para detectar niveles bajos de ácidos nucleicos. Por lo tanto, para mejorar su sensibilidad de detección, la detección de CRISPR-Cas12a se combina típicamente con un paso de amplificación isotérmica14,15. La amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) permite la amplificación isotérmica sensible y rápida del ADN en un rango de temperatura de 37 °C a 42 °C19.
Una plataforma de detección llamada DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) que combina la actividad DNasa de Cas12a con RPA y una lectura de fluorescencia ha sido ideada recientemente12 y se ha demostrado que detecta ácido nucleico con mayor sensibilidad20. Además, la señal de fluorescencia emitida por las muestras positivas se puede observar a través de un dispositivo portátil de detección de fluorescencia en el campo.
Dado que amplificamos el ADN con RPA, diseñamos crRNA dirigido al gen nrdB (ribonucleonucleotide reductase β– subunidad) de cinco copias específico para CLas21, y empleamos la actividad DNasa de la proteína Cas12a, llamamos a este método de detección CLas CLas-DETECTR. En comparación con los métodos de detección de CLas existentes, CLas-DETECTR es rápido, preciso, sensible e implementable.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio presenta un método rápido y portátil para detectar CLas denominado CLas-DETECTR, que combina los sistemas RPA y CRISPR-Cas12a. El flujo de trabajo se ilustra en la figura 1. CLas-DETECTR detecta CLas con especificidad y sensibilidad (Figura 2 y Figura 3). Además, utilizando muestras de hojas de Newhall, CLas-DETECTR detecta CLas con la misma sensibilidad que la qPCR (Figura 4</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado financieramente por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2021YFD1400805), el Programa Principal de Investigación y Desarrollo de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Jiangxi (20194ABC28007), Proyectos del Departamento de Educación de Jiangxi (GJJ201449) y la Innovación Colaborativa de Investigación Científica Agrícola Moderna en la Provincia de Jiangxi (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
Materials
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China | |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China | |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China | |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China | |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China | |
| Hole puncher | Deli | 114 | China | |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK | |
| NaOH | SCR | 10019718 | China | |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA | |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China | |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA | |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China | |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China | |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
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