Fältdistribuerbar Candidatus liberibacter asiaticus-detektion med rekombinaspolymerasförstärkning i kombination med CRISPR-Cas12a
Summary
I detta arbete utvecklades en snabb, känslig och portabel detektionsmetod för Candidatus Liberibacter asiaticus baserad på rekombinaspolymerasförstärkning i kombination med CRISPR-Cas12a.
Abstract
Tidig upptäckt av Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) av citrusodlare underlättar tidigt ingripande och förhindrar spridning av sjukdomar. En enkel metod för snabb och bärbar Huanglongbing (HLB) diagnos presenteras här som kombinerar rekombinaspolymerasförstärkning och en fluorescerande reporter som använder nukleasaktiviteten hos det grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar / CRISPR-associerade 12a (CRISPR-Cas12a) systemet. Känsligheten hos denna teknik är mycket högre än PCR. Dessutom visade denna metod liknande resultat som qPCR när bladprover användes. Jämfört med konventionella CLas-detektionsmetoder kan detektionsmetoden som presenteras här slutföras på 90 minuter och fungerar i ett isotermiskt tillstånd som inte kräver användning av PCR-maskiner. Dessutom kan resultaten visualiseras genom en handhållen fluorescerande detekteringsanordning i fältet.
Introduction
Huanglongbing (HLB) är en av de mest problematiska citrussjukdomarna i världen1. HLB orsakas av floemkoloniserande och krångliga bakterier Candidatus Liberibacter spp., inklusive Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus, och Ca. L. americanus 2. Den vanligaste HLB-associerade arten i Kina och USA är CLas, som överförs av asiatiska citruspsyllider (Diaphorina citri) eller genom ympning3. Efter att ha smittats av CLas visar citrusträd tillväxtminskning fram till döden2. De vanliga symptomen på citrusblad infekterade med CLas är fläckiga fläckar, gröna öar (små cirkulära mörkgröna prickar), upphöjda korkiga vener på tjockare och läderartade löv och icke-enhetliga gulnande skott2. Dessutom verkar frukter infekterade med CLas små och snedställda2.
Eftersom ingen citrussort är resistent mot HLB och det inte finns något terapeutiskt botemedel mot HLB, kräver förebyggande av HLB karantän och isolering av CLas-positiva citrusträd 2,3. Därför är tidig upptäckt avgörande för övervakning och karantän för att förhindra spridning av CLas och minimera ekonomiska förluster3. Dessutom behövs känslig CLas-detektion på grund av den låga titern av CLas i växter under det tidiga infektionsstadiet3. I Kina utförs CLas-detektering vanligtvis av vissa certifierade testcenter. Identifieringsprocessen tar dock vanligtvis minst 1 vecka och identifieringsavgiften är dyr. Därför, för att hjälpa till att övervaka HLB-incidensen
Olika tekniker har tillämpats för att diagnostisera HLB 4,5,6,7,8,9. Polymeraskedjereaktion (PCR) och kvantitativ PCR (qPCR) är de mest använda verktygen för CLas-detektion på grund av deras höga känslighet och specificitet 4,5. Dessa tekniker är dock starkt beroende av dyra instrument och högkvalificerad personal. Dessutom har flera isotermiska förstärkningsmetoder, såsom loopmedierad isotermisk förstärkning (LAMP), utvecklats som attraktiva alternativ till konventionella PCR-metoder på grund av deras enkelhet, snabbhet och låga kostnad 8,9,10. Det är dock utmanande att tillämpa dem för att exakt upptäcka CLas på grund av de icke-specifika förstärkningssignalerna, vilket kan orsaka falskt positiva resultat.
RNA-styrd CRISPR / Cas (grupperad regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar / CRISPR-associerade) endonukleasbaserad nukleinsyradetektering har utvecklats som nästa generations molekylära diagnostikteknik på grund av dess höga känslighet, specificitet och tillförlitlighet11,12,13,14. Dessa CRISPR/Cas-diagnostiktekniker förlitar sig på säkerhetsnukleasaktiviteten hos Cas-proteiner för att klyva enkelsträngat DNA (ssDNA) modifierat med en fluorescerande reporter och en fluorescenssläckare i varje ände av oligonukleotiderna, samt en fluorescensdetekteringsanordning för att fånga den frigjorda fluorescerande reportern11,12 . Nukleasaktiviteten hos flera Cas-effektorer som aktiveras av CRISPR RNA (crRNA) målduplex kan urskillningslöst klyva den omgivande icke-mål-ssDNA11. CRISPR-Cas12a (även kallat Cpf 1), ett klass 2-klass V-A CRISPR/CAS-SYSTEM, visar på flera fördelar jämfört med Cas9, såsom en lägre missmatchningstolerans och större specificitet13. Cas12a/crRNA-systemet har tillämpats för känslig och specifik detektion av nukleinsyrorna hos humana patogener och fytopatogener 14,15,16,17,18. Därför bör användning av Cas12a / crRNA-systemet möjliggöra noggrann och känslig detektion av nukleinsyran i CLas.
Cas12a ensam är inte teoretiskt känslig nog för att detektera låga nivåer av nukleinsyror. För att förbättra detektionskänsligheten kombineras därför CRISPR-Cas12a-detektion vanligtvis med ett isotermiskt förstärkningssteg14,15. Rekombinaspolymerasförstärkning (RPA) möjliggör känslig och snabb isotermisk DNA-förstärkning i ett temperaturområde från 37 °C till 42 °C19.
En detektionsplattform som heter DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) som kombinerar DNase-aktiviteten hos Cas12a med RPA och en fluorescensavläsning har nyligen utformats12 och har visat sig detektera nukleinsyra med högre känslighet20. Dessutom kan fluorescenssignalen som emitteras från de positiva proverna observeras genom en handhållen fluorescensdetekteringsanordning i fältet.
Eftersom vi förstärkte DNA med RPA, designade crRNA som riktade sig mot den femkopierade nrdB-genen (ribonukleotidreduktas β– subenhet) som är specifik för CLas21 och använde DNas-aktiviteten hos Cas12a-proteinet, kallade vi denna CLas-detektionsmetod CLas-DETECTR. Jämfört med befintliga CLas-detektionsmetoder är CLas-DETECTR snabb, exakt, känslig och distribuerbar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna studie presenterar en snabb och bärbar metod för att upptäcka CLas med namnet CLas-DETECTR, som kombinerar RPA- och CRISPR-Cas12a-systemen. Arbetsflödet illustreras i bild 1. CLas-DETECTR detekterar CLas med specificitet och känslighet (figur 2 och figur 3). Dessutom, med hjälp av Newhall-bladprover, detekterar CLas-DETECTR CLas med samma känslighet som qPCR (figur 4). I sy…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes ekonomiskt av Kinas nationella nyckel FoU-program (2021YFD1400805), Major Science and Technology R & D-programmet i Jiangxi-provinsen (20194ABC28007), Projekt från Jiangxi Education Department (GJJ201449) och Collaborative Innovation of Modern Agricultural Scientific Research i Jiangxi-provinsen (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
Materials
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China | |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China | |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China | |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China | |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China | |
| Hole puncher | Deli | 114 | China | |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK | |
| NaOH | SCR | 10019718 | China | |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA | |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China | |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA | |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China | |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China | |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
Referências
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
- Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
- Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
- Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
- Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
- Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
- Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’ in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
- Chertow, D. S. Next-generation diagnostics with CRISPR. Science. 360 (6387), 381-382 (2018).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
- Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
- Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
- Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
- Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
- Lobato, I. M., O’Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
- Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
- Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
- Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
- Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
- Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
- Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen (‘Candidatus Liberibacter asiaticus’) using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).
