JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

CRISPR-Cas12a ile Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu Kullanılarak Sahada Konuşlandırılabilir Candidatus Liberibacter asiaticus Tespiti

Published: December 23, 2022
doi:
10.3791/64070
, , , , , , ,
1China-USA Citrus Huanglongbing Joint Laboratory, National Navel Orange Engineering Research Center,Gannan Normal University, 2Department of Biological Sciences,Gannan Normal University, 3Citrus Research and Education Center, Department of Microbiology and Cell Science,University of Florida – Institute of Food and Agricultural Sciences

Summary

Bu çalışmada, Candidatus Liberibacter asiaticus için CRISPR-Cas12a ile kombine rekombinaz polimeraz amplifikasyonuna dayanan hızlı, hassas ve taşınabilir bir tespit yöntemi geliştirilmiştir.

Abstract

Candidatus Liberibacter asiaticus’un (CLas) narenciye yetiştiricileri tarafından erken tespiti, erken müdahaleyi kolaylaştırır ve hastalığın yayılmasını önler. Hızlı ve taşınabilir Huanglongbing (HLB) tanısı için rekombinaz polimeraz amplifikasyonunu ve kümelenmiş düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar / CRISPR ile ilişkili 12a (CRISPR-Cas12a) sisteminin nükleaz aktivitesini kullanan bir floresan muhabiri birleştiren basit bir yöntem sunulmaktadır. Bu tekniğin duyarlılığı PCR’den çok daha yüksektir. Ayrıca, bu yöntem yaprak örnekleri kullanıldığında qPCR’ye benzer sonuçlar göstermiştir. Geleneksel CLas algılama yöntemleriyle karşılaştırıldığında, burada sunulan algılama yöntemi 90 dakikada tamamlanabilir ve PCR makinelerinin kullanılmasını gerektirmeyen izotermal bir durumda çalışır. Ek olarak, sonuçlar sahadaki bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla görselleştirilebilir.

Introduction

Huanglongbing (HLB), dünya çapında en sorunlu narenciye hastalıklarından biridir1. HLB, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus ve Ca. L. americanus2 dahil olmak üzere floem kolonize edici ve titiz bakteriler Candidatus Liberibacter spp.‘den kaynaklanır. Çin ve ABD’de HLB ile ilişkili en yaygın tür, Asya narenciye psyllidleri (Diaphorina citri) veya aşılama yoluyla bulaşan CLas’tır3. CLas tarafından enfekte edildikten sonra, narenciye ağaçları ölüm2’ye kadar büyüme düşüşü gösterir. CLas ile enfekte olmuş narenciye yapraklarının yaygın semptomları lekeli benek, yeşil adalar (küçük dairesel koyu yeşil noktalar), daha kalın ve kösele yapraklar üzerinde yükseltilmiş mantarlı damarlar ve düzgün olmayan sararma sürgünleridir2. Ek olarak, CLas ile enfekte olmuş meyveler küçük ve orantısız görünür2.

Hiçbir narenciye çeşidi HLB’ye dirençli olmadığından ve HLB için terapötik bir tedavi olmadığından, HLB’nin önlenmesi CLas pozitif narenciye ağaçlarının karantinaya alınmasını ve izolasyonunu gerektirir 2,3. Bu nedenle, CLas’ın yayılmasını önlemek ve ekonomik kayıpları en aza indirmek için erken teşhis izleme ve karantinaya almak için kritiköneme sahiptir 3. Ek olarak, enfeksiyonun erken evresinde bitkilerde CLas’ın düşük titresi nedeniyle hassas CLas tespiti gereklidir3. Çin’de, CLas tespiti genellikle belirli sertifikalı test merkezleri tarafından gerçekleştirilir. Bununla birlikte, algılama işlemi genellikle en az 1 hafta sürer ve tespit ücreti pahalıdır. Bu nedenle, HLB insidansını izlemeye yardımcı olmak için

HLB 4,5,6,7,8,9 tanısında çeşitli teknolojiler uygulanmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve kantitatif PCR (qPCR), yüksek duyarlılıkları ve özgüllükleri nedeniyle CLas tespiti için en çok kullanılan araçlardır 4,5. Bununla birlikte, bu teknolojiler büyük ölçüde pahalı araçlara ve yüksek vasıflı personele dayanmaktadır. Ek olarak, döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) gibi çeşitli izotermal amplifikasyon yöntemleri, basitlikleri, hızları ve düşük maliyetleri nedeniyle geleneksel PCR yöntemlerine cazip alternatifler olarak geliştirilmiştir 8,9,10. Bununla birlikte, yanlış pozitif sonuçlara neden olabilecek spesifik olmayan amplifikasyon sinyalleri nedeniyle CLas’ı doğru bir şekilde tespit etmek için bunları uygulamak zordur.

RNA rehberliğinde CRISPR / Cas (düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar / CRISPR ile ilişkili kümelenmiş) endonükleaz bazlı nükleik asit tespiti, yüksek hassasiyeti, özgüllüğü ve güvenilirliği nedeniyle yeni nesil bir moleküler tanı teknolojisi olarak geliştirilmiştir11,12,13,14. Bu CRISPR / Cas teşhis teknolojileri, oligonükleotidlerin her iki ucunda bir floresan muhabir ve bir floresan söndürücü ile modifiye edilmiş tek sarmallı DNA’yı (ssDNA) parçalamak için Cas proteinlerinin kollateral nükleaz aktivitesine ve ayrıca serbest bırakılan floresan muhabirini yakalamak için bir floresan tespit cihazına dayanır11,12 . CRISPR RNA (crRNA) hedef dubleks tarafından aktive edilen birkaç Cas efektörünün nükleaz aktivitesi, çevredeki hedef olmayan ssDNA11’i ayrım gözetmeksizin parçalayabilir. Sınıf 2 tip V-A CRISPR/Cas sistemi olan CRISPR-Cas12a (Cpf 1 olarak da adlandırılır), Cas9 ile karşılaştırıldığında, daha düşük uyumsuzluk toleransı ve daha fazla özgüllük13 gibi çeşitli avantajlar gösterir. Cas12a/crRNA sistemi, insan patojenlerinin ve fitopatojenlerin nükleik asitlerinin hassas ve spesifik tespiti için uygulanmıştır 14,15,16,17,18. Bu nedenle, Cas12a / crRNA sisteminin kullanılması, CLas’ın nükleik asidinin doğru ve hassas bir şekilde algılanmasını sağlamalıdır.

Cas12a tek başına teorik olarak düşük nükleik asit seviyelerini tespit edecek kadar hassas değildir. Bu nedenle, algılama hassasiyetini artırmak için, CRISPR-Cas12a algılama tipik olarak bir izotermal amplifikasyon adımı14,15 ile birleştirilir. Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA), 37 °C ila 42 °C19 sıcaklık aralığında hassas ve hızlı izotermal DNA amplifikasyonu sağlar.

Cas12a’nın DNaz aktivitesini RPA ve floresan okuması ile birleştiren DETECTR (DNA Endonükleaz Hedefli CRISPR Trans Reporter) adlı bir tespit platformu yakın zamanda12 geliştirilmiştir ve nükleik asidi daha yüksek hassasiyetle tespit ettiği gösterilmiştir20. Ayrıca, pozitif numunelerden yayılan floresan sinyali, sahadaki bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla gözlemlenebilir.

DNA’yı RPA ile güçlendirdiğimizden, CLas 21’e özgü beş kopyalı nrdB (ribonükleotid redüktaz β– alt birim) genini hedefleyen crRNA’yı tasarladığımızdan veCas12a proteininin DNaz aktivitesini kullandığımızdan, buna CLas tespit yöntemini CLas-DETECTR adını verdik. Mevcut CLas algılama yöntemleriyle karşılaştırıldığında, CLas-DETECTR hızlı, doğru, hassas ve konuşlandırılabilir.

Protocol

1. CLas-DETECTR’ın yapımı NOT: CLas-DETECTR’ın yapımı dört adımlı bir işlemdir: çözelti hazırlama, narenciye toplam DNA izolasyonu, izotermal DNA amplifikasyonu ve sonuç görselleştirme. CLas-DETECTR testinin şeması Şekil 1A’da gösterilmiştir. Çözelti hazırlamaArabellek A’yı hazırlayın: %6 PEG 200’de 20 mM NaOH. 100 mL için, bir şişede 80 mL H2 O içine 113 mg NaOH ve 6 g PEG200ekleyin. Tüm PEG 200 çözü…

Representative Results

Burada, sahada HLB’yi teşhis etmek için RPA ve CRISPR-Cas12a sistemlerini tarayan taşınabilir bir platform olan CLas-DETECTR’ı tanımladık. CLas-DETECTR şeması Şekil 1A’da gösterilmiştir. CLas-enfekte olmuş ve HLB-enfekte olmamış Newhall ağaçlarından (Şekil 1B), CLas-DETECTR testine tabi tutulduğunda, HLB-enfekte olmuş numunede yeşil bir floresan sinyali görüldü, ancak HLB-enfekte olmamış numunede ve negatif kontrolde görülmedi (<strong…

Discussion

Bu çalışma, RPA ve CRISPR-Cas12a sistemlerini birleştiren CLas-DETECTR adlı CLas’ı tespit etmek için hızlı ve taşınabilir bir yöntem sunmaktadır. İş akışı Şekil 1’de gösterilmiştir. CLas-DETECTR, CLas’ı özgüllük ve hassasiyetle algılar (Şekil 2 ve Şekil 3). Ayrıca, Newhall yaprak örneklerini kullanan CLas-DETECTR, CLas’ı qPCR ile aynı hassasiyetle algılar (Şekil…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2021YFD1400805), Jiangxi Eyaleti Büyük Bilim ve Teknoloji Ar-Ge Programı (20194ABC28007), Jiangxi Eğitim Departmanı Projeleri (GJJ201449) ve Jiangxi Eyaletindeki Modern Tarımsal Bilimsel Araştırmaların İşbirlikçi İnovasyonu (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.

Materials

AxyPrep DNA Gel Extraction Kit Corning 09319KE1 China
Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Solarbio D1600 China
EnGen LbCas12a  TOLOBIO 32104-01 China
Ex Taq Version 2.0 plus dye TaKaRa RR902A China
Handheld fluorescent detection device  LUYOR 3415RG China
Hole puncher  Deli 114 China
Magnesium acetate, MgOAc TwistDx TABAS03KIT UK
NaOH SCR 10019718 China
NEB buffer 3.1  NEB B7203 USA
PCR strip tubes LABSELECT PST-0208-FT-C China
PEG 200  Sigma P3015 USA
PrimeSTAR Max DNA Polymeras TaKaRa R045A China
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder  New England Biolabs N0550S USA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) TaKaRa RR820B China
TwistAmp Basic TwistDx TABAS03KIT UK
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
  2. Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
  3. Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
  4. Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
  5. Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
  6. Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
  7. Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
  8. Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
  9. Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
  10. Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’ in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
  11. Chertow, D. S. Next-generation diagnostics with CRISPR. Science. 360 (6387), 381-382 (2018).
  12. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  13. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  14. Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
  15. Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
  16. Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
  17. Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
  18. Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
  19. Lobato, I. M., O’Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
  20. Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
  21. Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
  22. Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
  23. Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
  24. Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
  25. Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen (‘Candidatus Liberibacter asiaticus’) using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).

Tags

Candidatus Liberibacter AsiaticusHLBCLas-DETECTRRecombinase Polymerase AmplificationCRISPR-Cas12aField-deployableRapid DetectionIsothermal AmplificationCitrus DiseasePlant DNA ExtractionFluorescent Visualization
check_url/pt/64070?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Li, M., Qin, H., Long, Y., Cheng, M., Li, L., Huang, A., Wang, N., Duan, S. Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a. J. Vis. Exp. (190), e64070, doi:10.3791/64070 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image