Detta protokoll beskriver kristalliseringen av mikroskopiska iskristaller och klatrathydrater i mikrofluidiska anordningar, vilket möjliggör vätskeutbyte runt de bildade kristallerna. Detta ger oöverträffade möjligheter att undersöka kristalliseringsprocessen och bindningsmekanismerna hos hämmarna.
En exakt mekanistisk beskrivning av vattenkristallisering är utmanande och kräver några nyckelelement: utmärkt temperaturkontroll för att möjliggöra bildandet av enstaka mikroskopiska kristaller och ett lämpligt mikroskopisystem kopplat till det kalla steget. Metoden som beskrivs häri lägger till en annan viktig funktion som inkluderar utbyte av lösningar kring is- och klatrathydratkristaller. Det beskrivna systemet består av en kombination av unika och hemutvecklade instrument, inklusive mikrofluidik, högupplösta kalla steg och fluorescensmikroskopi. Det kalla steget var utformat för mikrofluidiska anordningar och möjliggör bildandet av is- / hydratkristaller i mikronstorlek inuti mikrofluidiska kanaler och utbyte av lösningar runt dem. Temperaturupplösningen och stabiliteten i det kalla steget är en millikelvin, vilket är avgörande för att kontrollera tillväxten av dessa små kristaller. Detta mångsidiga system används för att studera de olika processerna för is- och hydratkristallisering och mekanismen genom vilken tillväxten av dessa kristaller hämmas. Protokollet beskriver hur man förbereder mikrofluidiska anordningar, hur man odlar och kontrollerar mikroskopiska kristaller i de mikrofluidiska kanalerna och hur användningen av vätskeflödet runt is/ hydratkristaller ger nya insikter i kristallisering av vatten.
Frostskyddsproteiner (AFP) och frostskyddsglykoproteiner (AFGP) skyddar olika kallanpassade organismer från frostskador1. AFP och AFGP (generaliserade som AF(G)Ps) hämmar tillväxten av iskristaller genom att binda irreversibelt till deras ytor och hämma ytterligare tillväxt på grund av Gibbs-Thomson-effekten 2,3,4,5. Det resulterande gapet som bildas mellan smälttemperaturen, som i stort sett är oförändrad, och den nyligen deprimerade frysningstemperaturen kallas termisk hysteres (TH) och representerar en mätbar parameter som motsvarar AFP-aktivitet6. Användningen av AFP för att hämma istillväxt har långtgående och olika tillämpningar och erbjuder potentiell förbättring inom olika områden, inklusive kryokonservering, fryst livsmedelskvalitet och skydd av kallexponerade grödor.
Kristalliseringen av vatten vid låga temperaturer och höga tryck i närvaro av små organiska molekyler resulterar i bildandet av klatrathydrater (eller gashydrater), där det vanligaste hydratet är metanhydrat7. Kristalliseringen av metanhydrater i gas-/oljeflödesledningar kan orsaka pluggar, vilket kan orsaka explosioner på grund av gaständning 8,9,10. Nuvarande ansträngningar för att förhindra hydratkristallisering i flödeslinjer inkluderar användning av termodynamiska (alkoholer och glykoler) och kinetiska (främst polymerer) hämmare11,12,13,14. AFP har också visat sig binda till klatrathydratkristaller och hämma deras tillväxt, vilket pekar på den potentiella användningen av AFP för att hindra bildandet av pluggar och därigenom ge en grönare lösning15.
Mikrofluidik är en vanlig metod som används för att studera egenskaperna hos vätskor vid små provvolymer (ner till fL) som flödas genom ett nätverk av mikrokanaler16. Mikrokanalerna följer ett mönster skapat på en kiselskiva (formen) med litografi17. Ett vanligt material för att tillverka mikrofluidiska anordningar är polydimetylsiloxan (PDMS), vilket är billigt och relativt enkelt att arbeta med i forskningslaboratorier. Utformningen av funktionerna (kanalerna) är sammansatt med hänsyn till enhetens specifika syfte; Således kan den användas för en mängd olika applikationer, inklusive DNA-avkänning18, medicinsk diagnos19 och kristallisationsprocesser 3,20,21.
Detta protokoll beskriver en unik mikrofluidisk metod för att odla is- och hydratkristaller i mikronstorlek med olika hämmare, inklusive AFP och AFGP. För dessa experiment användes Tetrahydrofuran (THF) hydrater för att efterlikna egenskaperna hos metangashydrater22, som kräver specialutrustning för tryck- och temperaturkontroll23. Fluorescerande märkta AF (G) Ps användes för att visualisera och analysera adsorptionen av proteinerna till kristallytan, och i kombination med fluorescerande avbildning möjliggjorde det mikrofluidiska tillvägagångssättet erhållandet av nyckelfunktioner i bindningsprocessen för dessa molekyler till kristallytor.
Detta protokoll utformades för att utnyttja kombinationen av mikrofluidiskt flöde med mikroskopiska kristaller för att avslöja nya insikter om kristalltillväxt och dess hämning. Ett millikelvinupplöst temperaturkontrollerat kallt steg27 möjliggör kontroll av enstaka mikroskopiska kristaller belägna inuti mikrofluidiska kanaler, vilket möjliggör utbyte av lösningar runt dem. Medan tillverkningen av mikrofluidiska anordningar är standard och liknar vanliga metoder17,18, är kontrollen över tillväxt och smältning av kristaller inuti enheten unik och ny. Den mest kritiska komponenten i detta system är den fantastiska temperaturkontrollen, som uppnås genom att använda Peltier termoelektriska kylare, återkoppling från en termistor som ligger nära provet och en högupplöst temperaturregulator som styr återkopplingsslingan.
Ett annat kritiskt steg är själva lösningsutbytet, eftersom kristallerna kan smälta eller växa under denna process; Således måste temperaturen justeras under lösningsutbytet för att förhindra tillväxt / smältning. Bildandet av kristaller i mikrofluidiska kanaler stör vätskeflödet och utgör den största utmaningen för detta system; Således måste tillväxten av dessa kristaller kontrolleras. Här monterades en IR-laser (980 nm) på det inverterade mikroskopet och användes för att lokalt smälta oönskade is/hydratkristaller28. Om en sådan laser inte kan användas kan metallkontakterna i den mikrofluidiska anordningen värmas upp med en extra Peltier termoelektrisk kylare, som smälter isen i enhetens inlopp/utlopp.
Metoden som beskrivs här inkluderar hemutvecklade instrument (kallt stadium) och kräver utbildning, eftersom några av de ovan nämnda stegen är utmanande. Eftersom koncentrationen av lösningen som omger kristallerna kan förändras även när flödet inte är avsett, kan ett enkelt kalibreringssteg5 ge en tillförlitlig uppskattning av koncentrationen baserat på fluorescenssignalen. En annan möjlig lösning på oönskat flöde (till exempel under TH-mätningar) är mikrofluidiska ventiler, som beskrivs i referens4.
Detta system användes också för att utforska tillväxtbeteendet hos D2O-is iH2O-vätska, en studie som avslöjade ett nytt fenomen av mikroskopiska, skulpterade isytor27. Således kan mikrofluidik användas vid studier av olika kristallina system som svarar väl på temperaturförändringar.
The authors have nothing to disclose.
Erkännande görs till givarna av American Chemical Society Petroleum Research Fund för stöd till denna forskning (bidragsnummer 60191-UNI5). Författarna vill tacka professor Ido Braslavsky för banbrytande användning av mikrofluidiska enheter för att studera frostskyddsproteiner och is. Författarna är tacksamma mot prof. Arthur DeVries, prof. Konrad Meister och prof. Peter Davies för att ha tillhandahållit frostskyddsproteinprover.
0.22-micron filters | Fisher Scientific | ||
90-degree bent blunt needles | 18 Gauge | ||
Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins | A gift | See references 5 and 28 | |
Blunt needles | 18 Gauge and 20 Gauge | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | ||
Cold stage | Home made | ||
Cover slips | Globe Scientific | 18 X 18 mm, 0.14 mm thickness | |
Glass syringe | |||
Infrared laser 980 nm | Opto Engine LLC | ||
Inverted microscope, Eclipse Ti – S | Nikon | ||
Invisible tape | Staples | ||
lint-free wipe | Kimwipes | ||
Newport 3040 temperature controller | Newport 3040 | ||
NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
Oil vacuum pump | Harrick Plasma | ||
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit) | Dow Corning Syglard | ||
Safranine O | Sigma-Aldrich | S2255-25G | |
Sapphire disc | Ted Pella Inc | 16005-1010 | 25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness |
sCMOS Camera, Neo 5.5 | Andor | ||
Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-100ML | |
Tygon Microbore tubing for microfluidic device | Cole-Parmer | 0.020" ID, 0.060"OD, 100 ft/roll. | |
Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas | Cole-Parmer | 1/8” ID, 3/16” OD |