설치류 심장에서의 바이러스 전이 유전자 발현 및 심장 부정맥 위험 평가
Summary
본 프로토콜은 심초음파유도 하에 바이러스의 직접 심내내 주사에 의해 래트 및 마우스 심장에서 전이유전자 발현을 위한 방법을 기술한다. 격리 된 Langendorff 관류 심장의 프로그램 된 전기 자극에 의한 심실 부정맥에 대한 심장의 감수성을 평가하는 방법도 여기에 설명되어 있습니다.
Abstract
심장병은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 취급의 용이성과 형질 전환 균주의 풍부함으로 인해 설치류는 심혈관 연구의 필수 모델이되었습니다. 그러나 심장병 환자에서 종종 사망을 유발하는 자발적인 치명적인 심장 부정맥은 설치류 심장 질환 모델에서 드뭅니다. 이것은 주로 인간과 설치류 사이의 심장 전기적 특성의 종 차이 때문이며 설치류를 이용한 심장 부정맥 연구에 도전을 제기합니다. 이 프로토콜은 재조합 바이러스 (아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)의 심초음파-유도 근육내 주사를 사용하여 마우스 및 래트 심실 심근에서 효율적인 전이유전자 발현을 가능하게 하는 접근법을 설명한다. 이 연구는 또한 아드레날린 성 및 프로그램 된 전기 자극을 모두 사용하여 분리 된 Langendorff 관류 마우스 및 쥐 심장을 사용하여 부정맥에 대한 심장 감수성을 신뢰할 수있는 평가를 가능하게하는 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 심근 경색과 같은 부상 후 불리한 심장 리모델링과 관련된 심장 리듬 장애를 연구하는 데 중요합니다.
Introduction
심혈관 질환은 전 세계적으로 주요 사망 원인으로 2017년에만 1,800만 명의 목숨을 앗아갔습니다1. 설치류, 특히 마우스와 쥐는 취급의 용이성과 다양한 형질전환 과발현 또는 녹아웃 라인의 가용성으로 인해 심혈관 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 모델이 되었습니다. 설치류 모델은 질병 메커니즘을 이해하고 심근 경색2, 고혈압3, 심부전4 및 죽상 동맥 경화증5에서 잠재적 인 새로운 치료 표적을 식별하는 데 기본이되었습니다. 그러나 심장 부정맥 연구에서 설치류의 사용은 인간 또는 대형 동물 모델에 비해 작은 심장 크기와 빠른 심박수로 인해 제한됩니다. 따라서 심근 경색 후 생쥐 또는 쥐의 자발적인 치명적인 부정맥은 드물다2. 연구자들은 부정맥 부담이나 부정맥 경향의 의미있는 변화를 보여주지 않고 섬유증이나 유전자 발현과 같은 친 부정맥 기질을 반영 할 수있는 간접적 인 2 차 변화에 집중해야합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 유전자 변형 6,7 또는 심근 경색2 후에 심실 성 빈맥에 대한 마우스 및 래트 심장의 감수성을 신뢰성있게 평가할 수있는 방법이 본 프로토콜에 기재되어있다. 이 방법은 아드레날린 수용체 자극과 프로그램 된 전기 자극을 결합하여 분리 된 Langendorff 관류8 마우스 및 쥐 심장에서 심실 성 빈맥을 유도합니다.
설치류 심근 조직에서 바이러스 유전자 전달을위한 표준 접근법은 종종 침습적 절차이며 절차 후 동물의 회복 지연과 관련된 개흉술 9,10,11에 의한 심장 노출을 포함합니다. 이 논문은 전이유전자의 과발현에 대한 초음파 영상 유도 하에 바이러스를 직접 심근내 주사하는 방법을 설명한다. 이 덜 침습적 인 절차는 개흉술에 비해 바이러스 주사 후 더 빠른 동물 회복과 조직 손상을 허용하고 동물의 수술 후 통증과 염증을 줄여 심장 기능에 대한 형질 전환 유전자의 효과를 더 잘 평가할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Langendorff-관류 및 격리 된 심장 준비의 성공을 위해서는 몇 가지 단계가 중요합니다. 첫째, 심장 수집 중 심장 손상을 피하는 것이 중요합니다 (예 : 실수로 짜내거나 가위로 자르는 경우). 둘째, 수집 된 심장을 가능한 한 빨리 차가운 Tyrode 용액에 넣는 것이 심장 박동을 멈추고 심장의 산소 소비를 줄이기 때문에 중요합니다. 셋째, 대동맥에 삽입하는 바늘이 너무 깊어서는 안되며, 이상적으로는 바…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 캐나다 보건 연구소 (CIHR) 프로젝트 보조금 (PJT-148918 및 PJT-180533, WL), CIHR 조기 경력 조사자 상 (AR8-162705, WL), 캐나다 심장 및 뇌졸중 재단 (HSFC) 맥도날드 장학금 및 신규 조사자 상 (S-17-LI-0866, WL), 학생 장학금 (JW 및 YX), 오타와 대학교 심장 기부 기금의 박사후 연구원 (AL로). 저자는 Richard Seymour 씨의 기술 지원에 감사드립니다. 그림 2 는 승인된 라이선스가 있는 Biorender.com 사용하여 작성되었습니다.
Materials
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
Referências
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