Expresión de transgenes virales en corazones de roedores y la evaluación del riesgo de arritmia cardíaca
Summary
El presente protocolo describe métodos para la expresión transgénica en corazones de rata y ratón mediante inyección intramiocárdica directa del virus bajo guía ecocardiográfica. Los métodos para la evaluación de la susceptibilidad de los corazones a las arritmias ventriculares mediante la estimulación eléctrica programada de corazones aislados, perfundidos con Langendorff, también se explican aquí.
Abstract
La enfermedad cardíaca es la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Debido a la facilidad de manejo y abundancia de cepas transgénicas, los roedores se han convertido en modelos esenciales para la investigación cardiovascular. Sin embargo, las arritmias cardíacas letales espontáneas que a menudo causan mortalidad en pacientes con enfermedades cardíacas son raras en modelos roedores de enfermedad cardíaca. Esto se debe principalmente a las diferencias de especies en las propiedades eléctricas cardíacas entre humanos y roedores y plantea un desafío para el estudio de las arritmias cardíacas utilizando roedores. Este protocolo describe un enfoque para permitir la expresión transgénica eficiente en miocardio ventricular de ratón y rata utilizando inyecciones intramusculares guiadas por ecocardiografía de virus recombinantes (adenovirus y virus adenoasociados). Este trabajo también describe un método para permitir una evaluación confiable de la susceptibilidad cardíaca a las arritmias utilizando corazones aislados de ratón y rata perfundidos por Langendorff con estimulaciones eléctricas adrenérgicas y programadas. Estas técnicas son críticas para estudiar los trastornos del ritmo cardíaco asociados con la remodelación cardíaca adversa después de lesiones, como el infarto de miocardio.
Introduction
Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en todo el mundo, cobrando la vida de 18 millones de personas solo en 20171. Los roedores, especialmente ratones y ratas, se han convertido en el modelo más utilizado en la investigación cardiovascular debido a la facilidad de manejo y la disponibilidad de varias líneas de sobreexpresión o knockout transgénicas. Los modelos de roedores han sido fundamentales para comprender los mecanismos de la enfermedad y para identificar posibles nuevas dianas terapéuticas en el infarto de miocardio2, la hipertensión3, la insuficiencia cardíaca4 y la aterosclerosis5. Sin embargo, el uso de roedores en estudios de arritmias cardíacas está limitado por su pequeño tamaño cardíaco y frecuencia cardíaca más rápida en comparación con los modelos humanos o animales grandes. Por lo tanto, las arritmias letales espontáneas en ratones o ratas después del infarto de miocardio son raras2. Los investigadores se ven obligados a centrarse en cambios secundarios indirectos que podrían reflejar un sustrato pro-arrítmico, como la fibrosis o la expresión génica, sin mostrar cambios significativos en la carga de arritmias o tendencias pro-arrítmicas. Para superar esta limitación, en el presente protocolo se describe un método que permite una evaluación fiable de la susceptibilidad de los corazones de ratón y rata a las taquiarritmias ventriculares después de la modificación genética 6,7 o del infarto de miocardio 2. Este método combina la estimulación del receptor adrenérgico con la estimulación eléctrica programada para inducir taquiarritmias ventriculares en corazones aislados de8 ratones y ratas perfundidos por Langendorff.
Los enfoques estándar para la transferencia de genes virales en el tejido miocárdico de roedores a menudo implican la exposición del corazón por toracotomía 9,10,11, que es un procedimiento invasivo y se asocia con retraso en la recuperación de los animales después del procedimiento. Este artículo describe un método de inyección intramiocárdica directa de virus bajo guía de imágenes de ultrasonido para la sobreexpresión de transgenes. Este procedimiento menos invasivo permite una recuperación más rápida del animal después de la inyección viral y menos lesiones tisulares, en comparación con la toracotomía, reduce el dolor postoperatorio y la inflamación en el animal y, por lo tanto, permite una mejor evaluación de los efectos de los genes transgénicos en la función cardíaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varios pasos son críticos para el éxito de la preparación cardíaca aislada perfundida por Langendorff. En primer lugar, es importante evitar cualquier daño al corazón durante la recolección del corazón (por ejemplo, debido a apretar o cortar accidentalmente con las tijeras). En segundo lugar, es fundamental poner el corazón recogido en una solución fría de Tyrode lo antes posible, ya que esto detendrá los latidos del corazón y reducirá el consumo de oxígeno del corazón. En tercer lugar, la inserción de l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las Subvenciones para Proyectos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (PJT-148918 y PJT-180533, a WL), el Premio al Investigador de Carrera Temprana del CIHR (AR8-162705, a WL), la Beca McDonald de la Fundación del Corazón y el Accidente Cerebrovascular de Canadá (HSFC) y el Premio al Nuevo Investigador (S-17-LI-0866, a WL), Becas Estudiantiles (a JW y YX) y una Beca Postdoctoral (a AL) de los Fondos de Dotación Cardíaca de la Universidad de Ottawa en el Instituto del Corazón. Los autores agradecen al Sr. Richard Seymour por su apoyo técnico. La figura 2 se creó con Biorender.com con licencias aprobadas.
Materials
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
Referências
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Wang, J., et al. Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Scientific Reports. 11 (1), 17722 (2021).
- Wang, T., et al. Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats. Physiological Reports. 7 (24), 14323 (2019).
- Lin, H. B., et al. Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance. Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).
- Karunakaran, D., et al. RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice. Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).
- Gharibeh, L., et al. GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118 (2021).
- Lu, A., et al. Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling. Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).
- Liang, W., et al. Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility. Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).
- Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies. Scientific Reports. 9 (1), 6930 (2019).
- Cingolani, E., et al. Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy. Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).
- Ionta, V., et al. SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability. Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).
- Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine. Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).
- Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).
- Hong, P., et al. NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121 (2019).
- Lin, H. B., et al. Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes. Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).
- Lin, H. B., et al. Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state. Frontiers in Immunology. 12, 737170 (2021).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Allison, S., et al. Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).
- Hamel, V., et al. De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges. Stem Cells International. 2017, 4528941 (2017).
- Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331 (2017).
- McLaughlin, S., et al. Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 4866 (2019).
- Villanueva, M., et al. Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction. Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).
- Kanda, P., et al. Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells. Biomaterials. 247, 120010 (2020).
