Expressão Transgênica Viral em Corações de Roedores e Avaliação do Risco de Arritmia Cardíaca
Summary
O presente protocolo descreve métodos de expressão transgênica em corações de ratos e camundongos por injeção intramiocárdica direta do vírus sob orientação ecocardiográfica. Métodos para a avaliação da suscetibilidade de corações a arritmias ventriculares pela estimulação elétrica programada de corações isolados, perfundidos por Langendorff, também são explicados aqui.
Abstract
A doença cardíaca é a principal causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Devido à facilidade de manuseio e abundância de cepas transgênicas, os roedores tornaram-se modelos essenciais para a pesquisa cardiovascular. No entanto, arritmias cardíacas letais espontâneas que muitas vezes causam mortalidade em pacientes com doença cardíaca são raras em modelos de roedores de doença cardíaca. Isto é principalmente devido às diferenças de espécies nas propriedades elétricas cardíacas entre humanos e roedores e representa um desafio para o estudo de arritmias cardíacas usando roedores. Este protocolo descreve uma abordagem para permitir a expressão transgênica eficiente no miocárdio ventricular de camundongos e ratos usando injeções intramusculares guiadas por ecocardiografia de vírus recombinante (adenovírus e vírus adenoassociado). Este trabalho também descreve um método para permitir uma avaliação confiável da suscetibilidade cardíaca a arritmias usando corações isolados de camundongos e ratos perfundidos por Langendorff com estímulos elétricos adrenérgicos e programados. Essas técnicas são fundamentais para o estudo de distúrbios do ritmo cardíaco associados ao remodelamento cardíaco adverso após lesões, como o infarto do miocárdio.
Introduction
A doença cardiovascular é a principal causa de morte em todo o mundo, ceifando a vida de 18 milhões de pessoas apenas em 20171. Roedores, especialmente camundongos e ratos, tornaram-se o modelo mais comumente usado em pesquisas cardiovasculares devido à facilidade de manuseio e à disponibilidade de várias linhas de superexpressão ou knockout transgênicas. Modelos de roedores têm sido fundamentais para a compreensão dos mecanismos da doença e para a identificação de potenciais novos alvos terapêuticos no infarto do miocárdio2, hipertensãoarterial 3, insuficiência cardíaca4 e aterosclerose5. No entanto, o uso de roedores em estudos de arritmias cardíacas é limitado pelo seu pequeno tamanho cardíaco e frequência cardíaca mais rápida em comparação com modelos humanos ou animais de grande porte. Portanto, arritmias letais espontâneas em camundongos ou ratos após infarto do miocárdio são raras2. Os pesquisadores são forçados a se concentrar em alterações secundárias indiretas que possam refletir um substrato pró-arrítmico, como fibrose ou expressão gênica, sem mostrar mudanças significativas na carga de arritmia ou tendências pró-arrítmicas. Para superar essa limitação, um método que permite uma avaliação confiável da suscetibilidade de corações de camundongos e ratos a taquiarritmias ventriculares após modificação genética 6,7 ou infarto do miocárdio2 é descrito no presente protocolo. Este método combina a estimulação do receptor adrenérgico com a estimulação elétrica programada para induzir taquiarritmias ventriculares em8 corações isolados, perfundidos por Langendorff e camundongos.
As abordagens padrão para a transferência de genes virais no tecido miocárdico de roedores geralmente envolvem a exposição do coração por toracotomia 9,10,11, que é um procedimento invasivo e está associado ao atraso na recuperação dos animais após o procedimento. Este artigo descreve um método de injeção intramiocárdica direta de vírus sob orientação por ultrassonografia para a superexpressão de transgenes. Este procedimento menos invasivo permite uma recuperação animal mais rápida após a injeção viral e menos lesão tecidual, em comparação com a toracotomia, reduz a dor pós-operatória e a inflamação no animal e, assim, permite uma melhor avaliação dos efeitos dos genes transgênicos na função cardíaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Várias etapas são críticas para o sucesso da preparação cardíaca isolada e perfundida por Langendorff. Em primeiro lugar, é importante evitar qualquer dano ao coração durante a coleta do coração (por exemplo, devido a espremer ou cortar acidentalmente com a tesoura). Em segundo lugar, é fundamental colocar o coração coletado em solução de Tyrode frio o mais rápido possível, porque isso interromperá os batimentos cardíacos e reduzirá o consumo de oxigênio do coração. Em terceiro lugar, a inserção…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos Subsídios de Projeto do Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (PJT-148918 e PJT-180533, para WL), o CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, para WL), a Heart and Stroke Foundation of Canada (HSFC) McDonald Scholarship and New Investigator Award (S-17-LI-0866, para WL), Student Scholarships (para JW e YX) e uma bolsa de pós-doutorado (para AL) da University of Ottawa Cardiac Endowment Funds no Heart Institute. Os autores agradecem ao Sr. Richard Seymour por seu apoio técnico. A Figura 2 foi criada com Biorender.com com licenças aprovadas.
Materials
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
Referências
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