Virale Transgenexpression in Nagetierherzen und die Bewertung des Risikos für Herzrhythmusstörungen
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Transgenexpression in Ratten- und Mausherzen durch direkte intramyokardiale Injektion des Virus unter echokardiographischer Leitung. Methoden zur Beurteilung der Anfälligkeit des Herzens für ventrikuläre Arrhythmien durch die programmierte elektrische Stimulation isolierter, Langendorff-durchbluteter Herzen werden hier ebenfalls erläutert.
Abstract
Herzerkrankungen sind weltweit die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität. Aufgrund der einfachen Handhabung und des Reichtums an transgenen Stämmen sind Nagetiere zu unverzichtbaren Modellen für die kardiovaskuläre Forschung geworden. Spontane letale Herzrhythmusstörungen, die bei Patienten mit Herzerkrankungen häufig zum Tod führen, sind jedoch in Nagetiermodellen für Herzerkrankungen selten. Dies ist in erster Linie auf die Unterschiede in den elektrischen Eigenschaften des Herzens zwischen Menschen und Nagetieren zurückzuführen und stellt eine Herausforderung für die Untersuchung von Herzrhythmusstörungen an Nagetieren dar. Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, um eine effiziente Transgenexpression im ventrikulären Myokard von Maus und Ratte unter Verwendung von echokardiografischen intramuskulären Injektionen von rekombinantem Virus (Adenovirus und Adeno-assoziiertes Virus) zu ermöglichen. Diese Arbeit skizziert auch eine Methode, die eine zuverlässige Beurteilung der kardialen Anfälligkeit für Arrhythmien unter Verwendung isolierter, Langendorff-perfundierter Maus- und Rattenherzen mit sowohl adrenergen als auch programmierten elektrischen Stimulationen ermöglicht. Diese Techniken sind entscheidend für die Untersuchung von Herzrhythmusstörungen, die mit einem nachteiligen kardialen Umbau nach Verletzungen wie Myokardinfarkt verbunden sind.
Introduction
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache und kostetenallein im Jahr 2017 18 Millionen Menschen das Leben1. Nagetiere, insbesondere Mäuse und Ratten, sind aufgrund der einfachen Handhabung und der Verfügbarkeit verschiedener transgener Überexpressions- oder Knockout-Linien zum am häufigsten verwendeten Modell in der kardiovaskulären Forschung geworden. Nagetiermodelle waren von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Krankheitsmechanismen und für die Identifizierung potenzieller neuer therapeutischer Ziele bei Myokardinfarkt2, Bluthochdruck3, Herzinsuffizienz4 und Atherosklerose5. Die Verwendung von Nagetieren in Studien zu Herzrhythmusstörungen ist jedoch durch ihre geringe Herzgröße und schnellere Herzfrequenz im Vergleich zu menschlichen oder großen Tiermodellen begrenzt. Daher sind spontane letale Arrhythmien bei Mäusen oder Ratten nach Myokardinfarkt selten2. Die Forscher sind gezwungen, sich auf indirekte sekundäre Veränderungen zu konzentrieren, die ein pro-arrhythmisches Substrat wie Fibrose oder Genexpression widerspiegeln könnten, ohne signifikante Veränderungen der Arrhythmiebelastung oder pro-arrhythmischer Tendenzen zu zeigen. Um diese Einschränkung zu überwinden, wird im vorliegenden Protokoll eine Methode beschrieben, die eine zuverlässige Beurteilung der Anfälligkeit von Mäuse- und Rattenherzen für ventrikuläre Tachyarrhythmien nach genetischer Veränderung 6,7 oder Myokardinfarkt2 ermöglicht. Diese Methode kombiniert die adrenerge Rezeptorstimulation mit der programmierten elektrischen Stimulation, um ventrikuläre Tachyarrhythmien in isolierten, Langendorff-perfundierten8 Maus- und Rattenherzen zu induzieren.
Standardansätze für den viralen Gentransfer in Nagetier-Myokardgewebe beinhalten häufig die Exposition des Herzens durch die Thorakotomie 9,10,11, die ein invasives Verfahren ist und mit einer verzögerten Genesung der Tiere nach dem Eingriff verbunden ist. Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur direkten intramyokardialen Injektion von Viren unter Ultraschallbildgebung zur Überexpression von Transgenen. Dieses weniger invasive Verfahren ermöglicht im Vergleich zur Thorakotomie eine schnellere Genesung der Tiere nach der Virusinjektion und weniger Gewebeverletzungen, reduziert postoperative Schmerzen und Entzündungen beim Tier und ermöglicht somit eine bessere Beurteilung der Auswirkungen transgener Gene auf die Herzfunktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mehrere Schritte sind entscheidend für den Erfolg der Langendorff-durchbluteten, isolierten Herzpräparation. Erstens ist es wichtig, eine Schädigung des Herzens während der Herzentnahme zu vermeiden (z.B. durch versehentliches Quetschen oder Schneiden mit der Schere). Zweitens ist es wichtig, das gesammelte Herz so schnell wie möglich in kalte Tyrode-Lösung zu geben, da dies den Herzschlag stoppt und den Sauerstoffverbrauch des Herzens reduziert. Drittens darf das Einführen der Nadel in die Aorta nicht zu tief sei…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Projektzuschüsse der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (PJT-148918 und PJT-180533 an WL), den CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, an WL), das McDonald-Stipendium und den New Investigator Award der Heart and Stroke Foundation of Canada (HSFC) (S-17-LI-0866, an WL), Studentenstipendien (an JW und YX) und ein Postdoc-Stipendium (an AL) von den Cardiac Endowment Funds der University of Ottawa am Heart Institute. Die Autoren danken Herrn Richard Seymour für seine technische Unterstützung. Abbildung 2 wurde mit Biorender.com mit genehmigten Lizenzen erstellt.
Materials
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
Referências
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