Reconstituição da Assembleia septina em membranas para estudar propriedades e funções biofísicas

Summary

A reconstituição livre de células tem sido uma ferramenta fundamental para entender a montagem do citoesqueleto, e o trabalho na última década estabeleceu abordagens para estudar a dinâmica dos septins em sistemas mínimos. Aqui apresentados estão três métodos complementares para observar a montagem de septina em diferentes contextos de membrana: bicamadas planares, suportes esféricos e suportes de hastes.

Abstract

A maioria das células pode sentir e mudar sua forma para realizar processos celulares fundamentais. Em muitos eucariotes, o citoesqueleto de septina é um componente integral na coordenação de mudanças de forma como citocinese, crescimento polarizado e migração. Os septinas são proteínas formadoras de filamentos que se reúnem para formar diversas estruturas de alta ordem e, em muitos casos, são encontradas em diferentes áreas da membrana plasmática, mais notavelmente em regiões de curvatura positiva em escala de mícon. O monitoramento do processo de montagem de septina in vivo é dificultado pelas limitações da microscopia de luz nas células, bem como pela complexidade das interações com membranas e elementos citoesqueléticos, dificultando a quantificação da dinâmica do septino nos sistemas vivos. Felizmente, houve progressos substanciais na última década na reconstituição do citoesqueleto de septina em um sistema livre de células para dissecar os mecanismos que controlam a montagem de septinas em altas resoluções espaciais e temporais. Os passos centrais da montagem de septina incluem associação de heterooligomeres de septina e dissociação com a membrana, polimerização em filamentos, e a formação de estruturas de alta ordem através de interações entre filamentos. Aqui, apresentamos três métodos para observar a montagem de septina em diferentes contextos: bicamadas de planar, suportes esféricos e suportes de hastes. Esses métodos podem ser usados para determinar os parâmetros biofísicos dos septinos em diferentes estágios de montagem: como octamers únicos que ligam a membrana, como filamentos, e como conjuntos de filamentos. Utilizamos esses parâmetros emparelhados com medidas de amostragem de curvatura e adsorção preferencial para entender como o sensor de curvatura opera em uma variedade de escalas de comprimento e tempo.

Introduction

As formas das células e muitos de seus compartimentos internos dependem das membranas lipídicas que as cercam. As membranas são estruturas viscoelásticas que podem ser deformadas através de interações com proteínas, triagem lipídica e atuação de forças internas e externas para gerar uma variedade de formas 1,2,3,4. Essas formas são frequentemente descritas em termos de curvatura de membrana. As células utilizam um conjunto diversificado de proteínas capazes de se reunir preferencialmente, ou "sensoriamento", curvaturas de membrana específica....

Protocol

NOTA: Formar bicamadas lipídicas suportadas requer a preparação de pequenas vesículas unilamellar monodisperadas (SUVs). Consulte um protocolo²⁴ publicado anteriormente na formação de SUV. Resumidamente, todos os SUVs são formados por sônica de sonda por 12 min no total a 70% de amplitude através de períodos de sônica de 4 min seguidos por períodos de descanso de 2 min em água gelada. As soluções de SUV devem ser bem esclarecidas e monodisperadas em tamanho. As distribuições de tamanho dos SUVs podem ser medidas, por exemplo, por dispersão dinâmica de luz²⁵.

1. Bicamas lipídicas de Plana....

Results

Após a preparação de cada SLB, os septinos ou a proteína de interesse podem ser incubados com o suporte desejado e imageados via TIRFM, microscopia confocal ou SEM. Os resultados aqui apresentados utilizam septinas recombinantemente expressas e purificadas de E. coli¹⁷. Utilizando o TIRFM em SLBs planar, é possível determinar o comprimento dos filamentos e sua flexibilidade, medir os coeficientes de difusão e observar a montagem ao longo do tempo ^28,29

Discussion

As membranas celulares assumem muitas formas diferentes, curvaturas e propriedades físico-químicas. Para estudar o maquinário em escala de nanômetros através do qual as células constroem conjuntos em escala de micrômetros, é necessário projetar sistemas mínimos de reconstituição de mimetéticas de membrana. Este protocolo apresenta técnicas que controlam precisamente a curvatura e a composição da membrana, permitindo ao usuário facilmente tomar medidas quantitativas de fluorescência usando técnicas de microscopia amplamen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de PCR de 0,2 mL com tampa plana, Natural	Watson	137-211C(EX)
Tubos de baixa adesão de 0,5 mL USA	Scientific	1405-2600
Beta mercaptoetanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A4612-25G
Coverglass para fazer lamínulas PEGylated	Thermo Scientific	152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Tampa de Vidro 24x50 #1.5
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375
Egg Liss Rhodamine PE	Avanti Polar Lipids	810146
EMS Glutaraldeído Aquoso 25%, Grau EM	VWR	16220
EMS Cacodilato de Sódio Buffer	VWR	11652
Etanol, 200 provas	Fisher Scientific	04-355-223EA
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Hexametildisilazane	Sigma-Aldrich	440191
Cloreto de magnésio	VWR	7791-18-6
Metilcelulose 4000cp	Sigma-Aldrich	M052-100G
Lamínulas de microvidro para bicamadas planares	Matsunami	Mini
descontinuada Microesferas de sílica não funcionalizada	Bangs Laboratories, Inc.	Depende do tamanho: SS0200*-SS0500*	Sílica em suspensão aquosa
Adesivo óptico	Norland Thorlabs	NOA 68	Adesivo flexível para vidro ou plásticos
Tetróxido de ósmio	Millipore Sigma	20816-12-0
Parafilm	VWR	52858-000
Limpador de plasma	Plasma Etch	PE-25	Voltagem: 120V, 60Hz. Corrente: 15 AMPS
Cloreto de potássio	VWR	0395-1kg
Tampa de lamínula redonda, #1.5 12mm	VWR	64-0712
Sonicator bath	Branson	1510R-MT	Bransonic Limpador ultrassônico. 50-60 Hz. Saída: 70W
Soja PI	Avanti Polar Lipids	840044
Centrífuga de mesa	Eppendorf	22331
Lâmpada UV	Spectroline	ENF-260C	115 Volts, 60 Hz, 0,20 AMPS
Papel de filtro de microfibra WhatmanGlass	VWR	28455-030	42,5 mm de diâmetro, grau GF/C