Imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma che invadono il cervello del pesce zebra
Summary
Riportiamo una tecnica che consente l’imaging dal vivo della dinamica dei microtubuli nelle cellule di glioblastoma (GBM) che invadono un tessuto cerebrale dei vertebrati. L’accoppiamento dell’iniezione ortotopica di cellule GBM marcate con fluorescenza in un cervello di zebrafish trasparente con imaging intravitale ad alta risoluzione consente la misurazione della dinamica del citoscheletro durante l’invasione del cancro in situ .
Abstract
Con un triste tempo di sopravvivenza mediano nelle popolazioni reali – tra 6 e 15 mesi – il glioblastoma (GBM) è il tumore cerebrale maligno più devastante. Il fallimento del trattamento è dovuto principalmente all’invasività delle cellule GBM, che parla della necessità di una migliore comprensione delle proprietà mobili GBM. Per studiare il meccanismo molecolare che supporta l’invasione del GBM, sono necessari nuovi modelli fisiologici che consentano una caratterizzazione approfondita della dinamica delle proteine durante l’invasione. Queste osservazioni aprirebbero la strada alla scoperta di nuovi bersagli per bloccare l’infiltrazione tumorale e migliorare i risultati dei pazienti. Questo articolo riporta come uno xenotrapianto ortotopico di cellule GBM nel cervello del pesce zebra consenta l’imaging dal vivo intravitale subcellulare. Concentrandoci sui microtubuli (MT), descriviamo una procedura per l’etichettatura MT nelle cellule GBM, la microiniezione di cellule GBM nel cervello trasparente delle larve di zebrafish 3 giorni dopo la fecondazione (DPF), l’imaging intravitale delle MT negli xenotrapianti disseminanti, l’alterazione della dinamica della MT per valutare il loro ruolo durante l’invasione GBM e l’analisi dei dati acquisiti.
Introduction
La motilità cellulare è un processo stereotipato che richiede la creazione dell’asse di polarità e riarrangiamenti citoscheletrici generatori di forza. La polimerizzazione dell’actina e la sua associazione con la miosina sono riconosciute come i principali contributori alle forze protrusive e contrattili richieste per il movimento cellulare1. I microtubuli sono considerati i principali attori della polarizzazione cellulare e della persistenza direzionale durante la migrazione2. Negli ultimi anni, le MT hanno anche dimostrato di creare e stabilizzare protrusioni per supportare le forze di meccanocompressione durante l’invasione cellulare in 3D3. Più recentemente, le MT sono state direttamente coinvolte nella meccanotrasduzione alle aderenze focali e nella migrazione meccanosensibile4. L’instabilità dinamica che caratterizza la dinamica finale MT-plus è costituita da ripetute fasi di polimerizzazione (crescita) e depolimerizzazione (restringimento), che sono controllate da una pletora di proteine leganti i microtubuli e cascate di segnalazione intracellulare, come quelle governate dalle RHO-GTPasi 5,6,7. Il ruolo della rete MT nella migrazione e nell’invasione cellulare ha reso lo studio delle dinamiche MT un elemento chiave per comprendere meglio i meccanismi di homing delle cellule immunitarie, guarigione delle ferite e invasione del cancro.
La capacità delle cellule tumorali di sfuggire al nucleo tumorale primario, diffondersi nei tessuti e generare tumori secondari è un passo fondamentale per prevenire il successo globale nella guerra contro il cancro dichiarata 50 anni fa 8,9. Uno dei maggiori ostacoli è stato capire come le cellule tumorali invadono attivamente il tessuto. I meccanismi chiave di invasione si basano sugli stessi principi di quelli che governano la migrazione cellulare non tumorale10. Tuttavia, le specificità di migrazione delle cellule tumorali sono emerse11, innescando la necessità di una migliore caratterizzazione di questo tipo di migrazione. In particolare, poiché il microambiente tumorale appare come un attore chiave nella progressione del cancro12, osservare e analizzare l’invasione delle cellule tumorali in un contesto fisiologico rilevante è essenziale per svelare i meccanismi di disseminazione delle cellule tumorali.
Le MT sono fondamentali per la progressione del cancro, per sostenere sia la proliferazione che l’invasione. Un’analisi precisa della dinamica della MT in situ può aiutare a identificare gli agenti che alterano la MT (MTA) de entrambi i processi. Le dinamiche MT variano drasticamente in base a un cambiamento di ambiente. In vitro, il trattamento con agenti destabilizzanti MT come il nocodazolo previene la formazione di protrusione cellulare quando le cellule sono incorporate in gel in 3D, mentre ha scarso effetto sulla migrazione cellulare 2D13,14. Sebbene tecnicamente impegnativi, i progressi nell’imaging intravitale consentono l’analisi in vivo della dinamica MT durante l’invasione delle cellule tumorali. Ad esempio, l’osservazione di MT in cellule di fibrosarcoma xenotrapiantate per via sottocutanea nei topi ha rivelato che i macrofagi associati al tumore influenzano la dinamica della MT nelle cellule tumorali15. Tuttavia, questi modelli murini comportano ampie procedure chirurgiche e rimangono insoddisfacenti per i tumori meno accessibili, come il tumore cerebrale altamente invasivo, GBM.
Nonostante un triste tempo medio di sopravvivenza di 15 mesi16, poco si sa sulla modalità di diffusione del GBM all’interno del parenchima cerebrale o sugli elementi molecolari chiave che sostengono l’invasione delle cellule GBM nel tessuto cerebrale. Il miglioramento del modello di xenotrapianto ortotopico murino (PDX) e la creazione di finestre craniche hanno offerto nuove prospettive per gli studi sull’invasione delle cellule GBM17,18. Tuttavia, a causa della qualità di imaging non ottimale, questo modello ha permesso principalmente l’imaging longitudinale di xenotrapianti superficiali e finora non è stato utilizzato con successo per studiare l’imaging subcellulare delle proteine del citoscheletro. Inoltre, sulla scia dell’ingiunzione “3R” di ridurre l’uso di roditori e sostituirli con vertebrati inferiori, sono stati stabiliti modelli alternativi.
Sfruttando l’immunità primitiva osservata nelle larve di zebrafish (Danio rerio), l’iniezione ortotopica di cellule GBM nel cervello del pesce è stata sviluppata 19,20,21. L’iniezione in prossimità dei ventricoli nel mesencefalo in via di sviluppo ricapitola la maggior parte della fisiopatologia umana del GBM21, e lo stesso modello preferito di invasione GBM come nella cooptazione uomo-vaso – è osservato22. Grazie alla trasparenza delle larve di pesce, questo modello consente la visualizzazione delle cellule GBM che invadono il cervello dalle aree peri-ventricolari dove si pensa che la maggior parte dei GBM si verifichino23.
Poiché le MT sono essenziali per l’invasione delle cellule GBM in vitro24,25, è necessaria una migliore caratterizzazione della dinamica della MT e l’identificazione dei regolatori chiave durante l’invasione cellulare. Tuttavia, ad oggi, i dati generati con il modello ortotopico zebrafish non hanno incluso l’analisi subcellulare delle dinamiche MT durante il processo di invasione. Questo articolo fornisce un protocollo per studiare le dinamiche della MT in vivo e determinare il suo ruolo durante l’invasione del cancro al cervello. A seguito di una marcatura stabile dei microtubuli, le cellule GBM vengono microiniettate a 3 dpf nel cervello delle larve di zebrafish e visualizzate in tempo reale ad alta risoluzione spazio-temporale durante la loro progressione nel tessuto cerebrale. L’imaging live di MT fluorescenti consente l’analisi qualitativa e quantitativa delle dinamiche plus-end di MT. Inoltre, questo modello consente di valutare in tempo reale l’effetto degli MTA sulla dinamica della MT e sulle proprietà invasive delle cellule GBM. Questo protocollo relativamente non invasivo combinato con un gran numero di larve gestite alla volta e la facilità di applicazione del farmaco (nell’acqua del pesce) rende il modello una risorsa per i test preclinici.
Protocol
Representative Results
Discussion
È probabile che l’imaging di xenotrapianti tumorali a risoluzione singola cellulare diventi uno strumento indispensabile per migliorare la nostra comprensione della biologia GBM. L’imaging dal vivo nei modelli PDX murini ha portato a preziose scoperte su come GBM invade collettivamente il tessuto cerebrale18. Tuttavia, ad oggi, la risoluzione spaziotemporale non è abbastanza alta da rivelare la dinamica delle proteine che controllano l’invasione GBM. Abbiamo ragionato che accoppiando l’attecchim…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo estremamente grati al Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Francia) e al suo laboratorio, in particolare Valérie Briolat, ed Emma Colucci-Guyon per averci fornito le linee zebrafish e lo stampo in plastica per le piastre di microiniezione, e per la loro preziosa esperienza sulle procedure sperimentali del pesce zebra. Riconosciamo con gratitudine UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, supportato dall’Agenzia nazionale francese per la ricerca France BioImaging, e ANR-10-INBS-04; Investimenti per il futuro). Questo lavoro è stato sostenuto dalla Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), il Centre National de la Recherche Scientifique, e l’Institut Pasteur e dalle generose donazioni della Sig.ra Marguerite MICHEL e del Sig. Porquet.
Materials
| Glioblastoma cell culture | |||
| Foetal calf serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reagent |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reagent |
| Modified Eagle's medium | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reagent |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | Cells |
| Lenitivirus production | |||
| BD FACSAria III | BD bioscience | Instrument | |
| BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscience | Software | |
| HEK-293T | Merck | 12022001 | Cells |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | Reagent |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | Reagent |
| Ultracentrifuge Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrument | |
| Cell passaging and staining | |||
| dPBS | Gibco | 14190-094 | Chemical |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Chemical |
| Trypsin-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reagent |
| Zebrafish husbandry | |||
| Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Instrument |
| Methylene Blue hydrate | Sigma-Aldrich | M4159 | Chemical |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | Chemical |
| Transfer Pipettes fine tips | Samco Scientific | 232 | Equipment |
| Transfer Pipettes Large Bulb3mL | Samco Scientific | 225 | Equipment |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Chemical |
| Volvic Source Water | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | 999556 | Reagent |
| Xenotransplantation | |||
| 24-well plate | TPP | 92024 | Equipment |
| Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) | Harvard Apparatus | (#30-0017 GC100-15 | Equipment |
| CellTram oil vario microinjector | Eppendorf | 5176000.025 | Instrument |
| Microloading pipet tips (Microloader) 20µL | Eppendorf | 5242956003 | Equipment |
| Micromanipulator | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html | Equipment |
| Mineral Oil | Sigma | M8410-100ml | Equipment |
| Stereomicroscope | Olympus | KL 2500 LCD | Instrument |
| Universal capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | Equipment |
| Vertical Pipette puller | KOPF (Roucaire) | Model 720 | Instrument |
| Intravital Imaging | |||
| 3.5cm glass-bottom videoimaging dish | MatTek Life Sciences, MA, USA | P35G-1,5-14-C | Equipment |
| Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 | Nikon | Software | |
| Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | Equipment |
| Microscope head Nikon Ti2E | Nikon | Instrument | |
| sCMOS camera Prime 95B | Photometrics | Instrument | |
| sCMOS camera Orca Flash 4 | Hammatsu | Instrument | |
| Ultrapure Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Chemical |
| Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit | Hammatsu | Instrument | |
| Drug Treatment | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Chemical |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Chemical |
| Image Analysis | |||
| Imaris 9.5.1 software | Oxford Instruments | Software | |
| ImarisFileConverter 9.5.1 | Oxford Instruments | Software |
Referências
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