Relatamos uma técnica que permite imagens ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma (GBM) invadindo um tecido cerebral de vertebrados. O acoplamento da injeção ortotópica de células GBM marcadas fluorescentemente em um cérebro transparente de peixe-zebra com imagens intravitais de alta resolução permite a medição da dinâmica do citoesqueleto durante a invasão do câncer in situ .
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Artigo de método
Imagem ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma invadindo o cérebro do peixe-zebra
Neste artigo
Resumo
Resumo
Com um tempo de sobrevida mediano sombrio em populações reais - entre 6 a 15 meses - o glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral maligno mais devastador. A falha do tratamento deve-se principalmente à invasividade das células GBM, o que fala da necessidade de uma melhor compreensão das propriedades móveis do GBM. Para investigar o mecanismo molecular que suporta a invasão de GBM, são necessários novos modelos fisiológicos que permitam uma caracterização aprofundada da dinâmica das proteínas durante a invasão. Essas observações abririam o caminho para a descoberta de novos alvos para bloquear a infiltração tumoral e melhorar os resultados dos pacientes. Este artigo relata como um xenoenxerto ortotópico de células GBM no cérebro do peixe-zebra permite imagens intravitais subcelulares vivas. Com foco em microtúbulos (MTs), descrevemos um procedimento para marcação de MT em células GBM, microinjeção de células GBM no cérebro transparente de larvas de peixe-zebra 3 dias após a fertilização (dpf), imagem intravital de MTs nos xenoenxertos disseminadores, alteração da dinâmica de MT para avaliar seu papel durante a invasão de GBM e análise dos dados adquiridos.
Introdução
A motilidade celular é um processo estereotipado que requer o estabelecimento do eixo polaridade e rearranjos citoesqueléticos geradores de força. A polimerização da actina e sua associação com a miosina são reconhecidas como os principais contribuintes para as forças protrusivas e contráteis necessárias para o movimento celular1. Os microtúbulos são considerados os principais atores na polarização celular e na persistência direcional durante a migração2. Nos últimos anos, os MTs também demonstraram criar e estabilizar saliências para suportar forças mecanocompressivas durante a invasão celular em 3D3
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Protocolo
As experiências com animais foram conduzidas de acordo com as orientações da União Europeia para o manuseamento de animais de laboratório. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Institut Pasteur - CEEA 89 e pelo Ministério da Pesquisa e Educação da França (alvará nº 01265.03). Durante as injeções ou sessões de imagem ao vivo, os animais foram anestesiados com Tricaine.At final dos procedimentos experimentais, foram eutanasiados por overdose anestésica. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados aos materiais, equipamentos e softwares usados neste protocolo. O fluxo de trabalho geral do....
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Resultados
Para analisar o papel desempenhado pelos MTs durante a invasão in vivo do GBM, descrevemos aqui os principais passos para realizar a marcação estável do MT em células GBM por infecção lentiviral, xenotransplante ortotópico de células GBM em larvas de peixe-zebra 3 dpf, imagens intravitais de alta resolução da dinâmica MT, tratamento MTA e seus efeitos na invasão GBM e análise de imagens da dinâmica MT e invasão in vivo (Figura 1). A dinâmica da MT é medid.......
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Discussão
A imagem de xenoenxertos tumorais em resolução unicelular provavelmente se tornará uma ferramenta indispensável para melhorar nossa compreensão da biologia do GBM. Imagens ao vivo em modelos PDX de camundongos levaram a descobertas valiosas sobre como o GBM invade coletivamente o tecido cerebral18. No entanto, até o momento, a resolução espaço-temporal não é alta o suficiente para revelar a dinâmica das proteínas que controlam a invasão de GBM. Raciocinamos que, ao acoplar o enxerto ortotópico de .......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Estamos extremamente gratos ao Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, França) e seu laboratório, especialmente Valérie Briolat e Emma Colucci-Guyon por nos fornecerem as linhas de peixe-zebra e o molde plástico para placas de microinjeção, e por sua valiosa experiência em procedimentos experimentais de peixe-zebra. Agradecemos a UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, apoiada pela Agência Nacional de Pesquisa da França BioImaging, e ANR-10-INBS-04; Investimentos para o Futuro). Este trabalho foi apoiado pela Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), o Centre National de la Recherche Scientifique, e o Institut Pasteur e pelas generosas doações da Sra. Marguerite M....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cultura de células de glioblastoma | |||
| Soro fetal de bezerro | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reagente |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reagente |
| Modificado Eagle's medium | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reagente |
| Penicilina– estreptomicina | Gibco | 15140-122 | reagente |
| U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | Células |
| produção de lenitivírus | |||
| FACSAria III | BD bioscience | instrumento | |
| BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscience | Software | |
| HEK-293T | Merck | 12022001 | Células |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | Reagente |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | Reagente |
| Ultracentrifuge Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrument | |
| Cell passaging and staining | |||
| dPBS | Gibco | 14190-094 | Chemical |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | |
| Tripsina-EDTA Química (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reagente |
| Criação de peixe-zebra | |||
| Estereomicroscópio de fluorescência LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Instrumento |
| Hidrato de azul de metileno | Sigma-Aldrich | M4159 | |
| N-feniltioureia química (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | Pipetas de transferência química |
| pontas finas | Samco Scientific | 232 | Transferência de equipamentos |
| Pipetas Bulbo Grande3mL | Samco Scientific | 225 | Equipamento |
| Tricaína (Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Água |
| Fonte Química Volvica | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | Reagente | |
| Xenotransplante | |||
| 24 poços | TPP | 92024 | Equipamento |
| Capilares de vidro borossilicato (1.0 ODx0.58IDx150L mm) | Aparelho Harvard | (#30-0017 GC100-15 | |
| Equipamento Microinjetor de óleo vario CellTram | Eppendorf | 5176000.025 | Instrumento |
| Microloading pipet tips (Microloader) 20µ L | Eppendorf | Equipamento 5242956003 | |
| Micromanipulador | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html | Equipamento |
| Óleo Mineral | Sigma | M8410-100ml | |
| Equipamento Estereomicroscópio | Olympus | KL 2500 LCD | |
| Instrumento Suporte capilar universal | Eppendorf | 5176190002 | Equipamento |
| Extrator de pipetas vertical | KOPF (Roucaire) | Modelo 720 | Instrumento |
| Imagem Intravital | |||
| prato de imagem de vídeo com fundo de vidro de 3,5 cm | MatTek Life Sciences, MA, EUA | P35G-1,5-14-C | |
| Software de aquisição de equipamento: NIS-Elements-AR versão 5.21 | Nikon | Software | |
| Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | Equipamento |
| Cabeça de microscópio Nikon Ti2E | Nikon | Instrumento | |
| câmera sCMOS Prime 95B | Instrumento | Fotométrico | |
| câmera sCMOS Orca Flash 4 | Instrumento Hammatsu | ||
| Ultrapuro Baixo ponto de fusão agarose | Invitrogen | 16520-050 | Químico |
| Yokagawa CSU-W1 disco giratório unidade | Hammatsu | Instrument | |
| Drug Treatment | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Chemical |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Chemical |
| Image Analysis | |||
| Imaris 9.5.1 software | Oxford Software de instrumentos | ||
| ImarisFileConverter 9.5.1 | Software de Oxford Instruments |
Referências
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
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Reimpressões e permissões
