Diese Studie stellt ein neues Protokoll vor, um mechanische Kraft direkt auf den Zellkern durch magnetische Mikroperlen auszuüben, die in das Zytoplasma abgegeben werden, und simultane Live-Zell-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen.
Eine grundlegende Frage in der Mechanobiologie ist, wie lebende Zellen extrazelluläre mechanische Reize im Kontext der Zellphysiologie und -pathologie wahrnehmen. Es wird angenommen, dass die zelluläre Mechano-Empfindung extrazellulärer mechanischer Reize durch die Membranrezeptoren, den zugehörigen Proteinkomplex und das Zytoskelett erfolgt. Jüngste Fortschritte in der Mechanobiologie zeigen, dass der Zellkern im Zytoplasma selbst selbstständig mechanische Reize gleichzeitig wahrnehmen kann. Ein mechanistisches Verständnis darüber, wie der Zellkern mechanische Reize wahrnimmt, umleitet und darauf reagiert, fehlt jedoch, hauptsächlich aufgrund der technischen Herausforderungen beim Zugriff auf und der Quantifizierung der Kernmechanik mit herkömmlichen Werkzeugen. Dieses Papier beschreibt das Design, die Herstellung und die Implementierung eines neuen magnetischen Kraftaktors, der präzise und nicht-invasive mechanische 3D-Reize anwendet, um den Zellkern direkt zu verformen. Unter Verwendung von CRISPR/Cas9-Zellen zeigt diese Studie, dass dieses Werkzeug in Kombination mit hochauflösender konfokaler fluoreszierender Bildgebung die Aufdeckung der Echtzeitdynamik eines mechanosensitiven yes-assoziierten Proteins (YAP) in einzelnen Zellen als Funktion der Kernverformung ermöglicht. Diese einfache Methode hat das Potenzial, die derzeitige Technologielücke in der Mechanobiologie zu schließen und Antworten auf die Wissenslücke zu geben, die in der Beziehung zwischen Kernmechanotransduktion und Zellfunktion besteht.
Diese Studie zielt darauf ab, eine neue Technik zur Aufklärung der Kernmechanobiologie zu entwickeln und anzuwenden, indem die magnetischen Aktoren, die mechanische Kraft direkt auf den Zellkern ausüben, und die konfokale Fluoreszenzmikroskopie, die gleichzeitig die strukturellen und funktionellen subzellulären Veränderungen abbildet, kombiniert werden. Zellen erfassen extrazelluläre biophysikalische Signale einschließlich Gewebesteifigkeit 1,2,3,4, interstitiellen Flüssigkeitsdruck und Scherspannung 5,6,7, Oberflächentopologie/-geometrie 8,9,10,11,12 und Zug-/Druckspannung13,14, 15,16. Biophysikalische Signale werden in biochemische Signale umgewandelt und lösen mögliche nachgeschaltete Veränderungen der Genexpression und des Zellverhaltens aus – ein Prozess, der als Mechanotransduktion bekannt ist 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Um Mechanotransduktionsprozesse zu untersuchen, wurde eine Vielzahl von Techniken entwickelt, um mechanische Kraft auf die Zellen auszuüben, wie Rasterkraftmikroskopie28, Zelldehnungsgerät29, Bio-MEMS (mikroelektromechanische Systeme) Kraftsensor 15,30,31, Scherrheologie 32 und Stereo Vision System 33 . Eine kürzlich durchgeführte Übersicht fasst die Ansätze zur Anwendung extrazellulärer mechanischer Hinweise und zur Störung der Mechanosensorik zusammen34. Bisher üben die meisten dieser Methoden Kraft auf die Zellplasmamembran aus, und Zellen empfangen diese extrazellulären biophysikalischen Signale direkt über Membranrezeptoren wie Integrin, Cadherin, Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Anschließend leiten sie das Signal an das intrazelluläre Zytoskelett und den Zellkern weiter. Zum Beispiel wird gezeigt, dass Zellen unter Verwendung der YAP-Translokation (Yes-assoziiertes Protein) als Indikator für die Mechano-Sensorik die mechanischen Signale der Substratsteifigkeit und extrazellulären Spannung von der Zellmembran wahrnehmen und durch das Zytoskelett in den Zellkern übertragen, um eine YAP-Zytoplasma-zu-Zellkern-Translokation zu induzieren28,35.
Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass der Zellkern selbst ein unabhängiger Mechanosensorist 8,36,37. Dies wird durch Experimente bewiesen, die an dem isolierten Kern aus Zellen durchgeführt wurden, wo gezeigt wurde, dass Kerne ihre Steifigkeit adaptiv als Reaktion auf die mechanische Kraft ändern, die direkt auf sie ausgeübt wird36. Unter vielen physiologischen Bedingungen nehmen Kerne sowohl in Tumor- als auch in gesunden Zellen extrazelluläre biophysikalische Signale wahr und verändern ihre mechanischen Eigenschaften und Anordnungen38,39,40. Zum Beispiel nimmt bei Extravasation die Kernsteifigkeit von Tumorzellen ab und hält die Weichheit für mehr als 24 h38 aufrecht. Während der Migration durch den begrenzten interstitiellen Raum verlieren die Kerne von Tumorzellen häufig ihre strukturelle Integrität und gewinnen sie wieder39. Die Art und Weise, wie der Zellkern das biophysikalische Signal wahrnimmt, ist jedoch unbekannt, obwohl mehrere Kernhüllproteine und Proteinfamilien beteiligt sind, wie Lamin A / C und Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC) -Komplex38,41. Neue nicht-invasive Methoden, die direkt Kraft auf den Zellkern ausüben können, werden daher die Wirkung der Kraftübertragung von der Zell-Plasma-Membran und dem Zytoskelett entkoppeln und dazu beitragen, die bisher unzugänglichen molekularen Mechanismen der nuklearen Mechano-Sensorik aufzuklären.
Forschungen, die optische Pinzetten zur Manipulation von Organellen42 und Mikroperlen, die in Zellen43 injiziert wurden, verwendeten, zeigten die technologische Fähigkeit, direkt Kraft auf den Kern auszuüben. Die optische Pinzettentechnik hat jedoch mehrere Einschränkungen: (1) optische Pinzetten mit niedrigem Durchsatz manipulieren oft nur eine Zelle oder Mikroperle gleichzeitig; und (2) potentielle Photoschäden und Temperaturartefakt-Verformungen von Kernkern erfordern Dutzende von pN36, und die entsprechende notwendige Laserleistung beträgt etwa 10 mW pro pN44,45. Eine solche Laserintensität ist ausreichend, um Photoschäden in den Zellen auszulösen und die Zellfunktionen während des Experiments46 zu stören.
Die magnetische Kraft, die durch Mikroperlen in lebenden Zellen ausgeübt wird, zeigt das Potenzial, direkt Kraft auf den Kern auszuüben und überwindet die Einschränkungen optischer Pinzetten. Sobald Mikroperlen in das Zytoplasma abgegeben werden, kann ein Magnetfeld eine magnetische Kraft auf mehrere Mikrokügelchen gleichzeitig und mit hohem Durchsatz ausüben. Das Magnetfeld beeinflusst nicht die Zellfunktionen47, sondern erzeugt Kraft von pN nach nN, was ausreicht, um eine Kernverformung 36,48,49 zu induzieren. Bisher wurde die Manipulation magnetischer Mikroperlen an der Zellplasmamembran48, im Zytoplasma50, an F-Aktin51, im Kern47 und am isolierten Kern36 angewendet. Die magnetische Manipulation von Mikroperlen wurde jedoch nie verwendet, um direkte mechanische Kraft auf die Kernhülle auszuüben, um die Mechanotransduktion im Kern zu untersuchen.
In dieser Arbeit wird eine einfache Technik entwickelt, um nicht-invasiv magnetische Mikroperlen in das Zytoplasma zu transportieren und diese Mikroperlen zu verwenden, um mechanische Kraft auf den Kern auszuüben (Abbildung 1). Hier werden CRISPR/Cas9-entwickelte humane normale B2B-Zelllinien, die endogen mNeonGreen21-10/11-markiertes YAP exprimieren, verwendet, um die Methode zu validieren. YAP ist ein mechanosensitives Protein, und die Translokation von YAP wird durch nukleare mechano-sensingreguliert 14,28. Der CRISPR/Cas9-regulierte Knock-in-Ansatz wurde gewählt, um endogenes YAP mit einem fluoreszierenden Protein (FP) mNeonGreen21-10/11 zu markieren. Obwohl bekannt ist, dass die CRISPR-Bearbeitung eine unvollständige Effizienz und einen Off-Target-Effekt hat, integrierten die Protokolle in früheren Publikationen eine Fluoreszenzsortierung, um die korrekte Einfügung des offenen Leserahmens52,53,54 auszuwählen. Mit dieser zusätzlichen Selektionsschicht wurde in 20+ Zelllinien, die zuvor52,53,54,55 erzeugt wurden, kein Off-Target-Tagging-Ereignis beobachtet. Dies ist ein Split-Fluoreszenzprotein-Konstrukt, aber im Prinzip könnte jede ausdrückbare fluoreszierende Markierung verwendbar sein. Dieser Markierungsansatz ist Transgen- oder Antikörpermethoden überlegen. Erstens behält das markierte Protein im Gegensatz zur Transgenexpression die Einzelkopie-Gendosierung bei und exprimiert im physiologischen Kontext des nativen genregulatorischen Netzwerks, wodurch Abweichungen in Proteinkonzentration, Lokalisation und Interaktion begrenzt werden. Die in dieser Studie verwendete Tagging-Methode erreicht über eine Größenordnung einen höheren Durchsatz und eine höhere Effizienz als das vollständige FP-Tagging. Es vermeidet auch Herausforderungen im Zusammenhang mit Immunfluoreszenz aufgrund von Fixierungsartefakten und der begrenzten Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Antikörpern mit hoher Spezifität. Zweitens führt der in dieser Arbeit verwendete Ansatz eine minimale Störung der Zellphysiologie durch und ermöglicht die authentische Offenbarung aller endogenen YAPs in Echtzeit. Im Gegensatz dazu führen andere gängige Transgenmethoden oft zu einer Überexpression von YAP. Die daraus resultierende künstliche Verteilung kann möglicherweise Zytotoxizität verursachen und die mechano-sensing von Zellenbeeinflussen 56,57,58.
Diese Studie stellt ein Protokoll vor, um durch magnetische Mikroperlen, die in das Zytoplasma abgegeben werden, direkt Kraft auf den Kern auszuüben und gleichzeitig eine Live-Zell-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Protokolle, wie man (1) magnetische Mikroperlen in die Zelle außerhalb des Kerns liefert, (2) die Mikroperlen manipuliert, um magnetische Kraft auf den Kern auszuüben, (3) konfokale fluoreszierende Bildgebung der Zellen während der Manipulation durchführt und (4) das YAP-Kern- / Zytoplasma-Verhältnis (N / C) während des gesamten Kraftanwendungsprozesses quantitativ analysiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass (1) durch Endozytose magnetische Mikrokügelchen innerhalb von 7 h nicht-invasiv in das Zytoplasma von B2B-Zellen abgegeben werden können (Abbildung 2 und Abbildung 3); und (2) quantifizierte magnetische Kraft, die direkt auf den Kern ausgeübt wird (Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6), kann allein verschiedene Änderungen des YAP N / C-Verhältnisses in CRISPR / Cas9-B-Zellen auslösen (Abbildung 7 und Abbildung 8).
Die Internalisierung magnetischer Mikroperlen (Abschnitt 2.2) ist von entscheidender Bedeutung, da extrazelluläre Mikroperlen keine Kraft direkt auf den Kern ausüben können. Krafteinleitung und Bildgebung (Abschnitt 5.3) sind kritische Schritte in diesem Experiment, und die Kraft, die benötigt wird, um den Kern zu verformen und sinnvolle biologische Konsequenzen zu induzieren, könnte probenabhängig sein. Die Kraftstärke in diesem Experiment (0,8 nN und 1,4 nN) kann weiter erhöht werden, um die nukleare Mechano-Se…
The authors have nothing to disclose.
Dieses Projekt wird durch das UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), den UFHCC Pilot Award (X. T. und Dr. Dietmar Siemann), den UF Opportunity Seed Fund (X. T.) und das UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang) finanziert. Wir schätzen die intellektuellen Gespräche und die fachliche Unterstützung durch Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurochirurgie), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie L-S Au (Institute of Quantitative Systems Pharmacology), Dr. David Hahn (University of Arizona), und Support-Team von Nikon (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon und Jon Ekman). Wir sind zutiefst dankbar für die effektive Unterstützung durch alle Mitglieder der Forschungslabors von Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann und Guan sowie alle Mitarbeiter der UF MAE-Abteilung.
0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
25 cm2 flask | Corning | 156340 | |
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads | N/A | N/A | |
A1R confocal system | Nikon | ||
Carbonyl Iron Powder CM | BASF | 30042253 | Magnetic microbead |
Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
Desktop Computer | Dell | with Windows 10 operating system | |
Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | ||
Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Magnet | K&J Magnetics, Inc. | D99-N52 | |
Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
NIS-Elements software platform | Nikon | software platform | |
Nucleus mask ImageJ macro | https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask | ||
NucSpot Live 650 | Biotium | #40082 | Nuclear stain |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Ti2-E inverted microscope | Nikon | ||
XYZ mover (CAD files) | https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover |