Denne studien presenterer en ny protokoll for direkte å anvende mekanisk kraft på cellekjernen gjennom magnetiske mikroperler levert inn i cytoplasma og å gjennomføre samtidig levende celle fluorescerende bildebehandling.
Et grunnleggende spørsmål i mekanobiologi er hvordan levende celler sanser ekstracellulære mekaniske stimuli i sammenheng med cellefysiologi og patologi. Den cellulære mekano-følelsen av ekstracellulære mekaniske stimuli antas å være gjennom membranreseptorene, det tilhørende proteinkomplekset og cytoskelettet. Nylige fremskritt innen mekanobiologi viser at cellekjernen i cytoplasma selv uavhengig kan fornemme mekaniske stimuli samtidig. Imidlertid mangler en mekanistisk forståelse av hvordan cellekjernen sanser, transduserer og reagerer på mekaniske stimuli, hovedsakelig på grunn av de tekniske utfordringene med å få tilgang til og kvantifisere kjernemekanikken ved konvensjonelle verktøy. Dette papiret beskriver design, fabrikasjon og implementering av en ny magnetisk kraftaktuator som bruker presise og ikke-invasive 3D-mekaniske stimuli for å deformere cellekjernen direkte. Ved hjelp av CRISPR / Cas9-konstruerte celler demonstrerer denne studien at dette verktøyet, kombinert med høyoppløselig konfokal fluorescerende avbildning, muliggjør åpenbaring av sanntidsdynamikken til et mekanofølsomt ja-assosiert protein (YAP) i enkeltceller som en funksjon av kjernedeformasjon. Denne enkle metoden har potensial til å bygge bro over dagens teknologigap i mekanobiologimiljøet og gi svar på kunnskapsgapet som eksisterer i forholdet mellom kjernemekanotransduksjon og cellefunksjon.
Denne studien tar sikte på å utvikle og anvende en ny teknikk for å belyse kjernemekanobiologi ved å kombinere magnetiske aktuatorer som bruker mekanisk kraft direkte på cellekjernen og konfokal fluorescensmikroskopi som samtidig bilder de strukturelle og funksjonelle subcellulære endringene. Celler registrerer ekstracellulære biofysiske signaler inkludert vevsstivhet 1,2,3,4, interstitielt væsketrykk og skjærspenning 5,6,7, overflatetopologi/geometri 8,9,10,11,12 og spennings-/kompresjonsspenning13,14, 15,16. Biofysiske signaler omdannes til biokjemiske signaler og utløser potensielle nedstrøms endringer i genuttrykk og celleoppførsel – en prosess kjent som mekanotransduksjon 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . For å studere mekanotransduksjonsprosesser er det utviklet et mylder av teknikker for å anvende mekanisk kraft på cellene, for eksempel atomkraftmikroskopi28, cellestrekkenhet29, bio-MEMS (mikroelektromekaniske systemer) kraftsensor 15,30,31, skjærreologi 32 og Stereo Vision System 33 . En nylig gjennomgang oppsummerer tilnærmingene til å bruke ekstracellulære mekaniske signaler og forstyrre mekanosensing34. Til dags dato bruker de fleste av disse metodene kraft på celleplasmamembranen, og celler mottar direkte disse ekstracellulære biofysiske signalene via membranreseptorer som integrin, cadherin, ionkanaler og G-proteinkoblede reseptorer. Deretter overfører de signalet til det intracellulære cytoskelettet og kjernen. For eksempel, ved bruk av ja-assosiert protein (YAP) translokasjon som en indikator på mekano-sensing, er celler vist å fornemme de mekaniske signalene av substratstivhet og ekstracellulær spenning fra cellemembranen og overføre dem gjennom cytoskelettet inn i kjernen for å indusere YAP cytoplasma-til-kjerne-translokasjon28,35.
Nylige bevis tyder på at selve cellekjernen er en uavhengig mekano-sensor 8,36,37. Dette er bevist ved eksperimenter utført på den isolerte kjernen høstet fra celler, hvor det ble avslørt at kjerner adaptivt endrer stivheten som svar på den mekaniske kraften som er direkte påført dem36. Under mange fysiologiske forhold registrerer kjerner i både tumor og friske celler ekstracellulære biofysiske signaler og endrer mekaniske egenskaper og samlinger38,39,40. For eksempel, ved ekstravasasjon, reduseres kjernestivheten til tumorceller og opprettholder mykhet i over 24 timer38. Under migrasjon gjennom begrenset interstitial plass, kjernene av tumorceller ofte miste og gjenopprette sin strukturelle integritet39. Imidlertid er måten kjernen registrerer det biofysiske signalet ukjent, selv om flere kjernekonvoluttproteiner og familier av proteiner har blitt funnet å være involvert, for eksempel Lamin A / C og linker av nukleoskeleton og cytoskelett (LINC) kompleks38,41. Derfor vil nye ikke-invasive metoder som direkte kan bruke kraft på kjernen, koble effekten av kraftoverføring fra celleplasmamembranen og cytoskelettet, og vil bidra til å belyse de tidligere utilgjengelige molekylære mekanismene for nukleær mekano-sensing.
Forskning som benyttet optisk pinsett for å manipulere organeller42 og mikroperler injisert i celler43 viste den teknologiske evnen til direkte å påføre kraft på kjernen. Imidlertid har den optiske pinsettteknikken flere begrensninger: (1) lav gjennomstrømning-optisk pinsett manipulerer ofte bare en celle eller mikroperle om gangen; og (2) potensiell fotoskade og temperaturartefaktdeformasjon av kjernekraft krever titalls pN36, og den tilsvarende nødvendige lasereffekten er ca. 10 mW per pN44,45. Slik laserintensitet er tilstrekkelig til å utløse fotoskader i cellene og forstyrre cellefunksjonene under forsøket46.
Magnetisk kraft påført gjennom mikroperler i levende celler viser potensialet til å direkte påføre kraft på kjernen og overvinne begrensningene til optisk pinsett. Når mikroperler leveres inn i cytoplasma, kan et magnetfelt utøve en magnetisk kraft på flere mikroperler samtidig på en høy gjennomstrømningsmåte. Magnetfeltet påvirker ikke cellefunksjonene47, men genererer kraft fra pN til nN, noe som er nok til å indusere kjernedeformasjon 36,48,49. Hittil har manipulering av magnetiske mikroperler blitt brukt på celleplasmamembran48, inne i cytoplasma50, på F-aktin51, inne i kjernen47 og på den isolerte kjernen36. Imidlertid har magnetisk manipulering av mikroperler aldri blitt brukt til å påføre direkte mekanisk kraft på atomkonvolutten for å studere mekanotransduksjon i kjernen.
I dette papiret utvikles en enkel teknikk for ikke-invasivt å levere magnetiske mikroperler inn i cytoplasma og bruke disse mikroperlene til å påføre mekanisk kraft på kjernen (figur 1). Her brukes CRISPR / Cas9-konstruerte menneskelige normale B2B-cellelinjer som endogent uttrykker mNeonGreen21-10/11-merket YAP for å validere metoden. YAP er et mekanofølsomt protein, og translokasjonen av YAP reguleres av nukleær mekano-sensing14,28. Den CRISPR/Cas9-regulerte knock-in-tilnærmingen ble valgt for å merke endogen YAP med et fluorescerende protein (FP) mNeonGreen21-10/11. Selv om CRISPR-redigering er kjent for å ha ufullstendig effektivitet og off-target-effekt, integrerte protokollene i tidligere publikasjoner fluorescenssortering for å velge riktig innsetting av åpen leseramme52,53,54. Med dette ekstra laget av utvelgelse ble det ikke observert noen merkingshendelse utenfor målet i 20+ cellelinjer som tidligere ble generert52,53,54,55. Dette er en delt fluorescerende proteinkonstruksjon, men i prinsippet kan enhver ekspressibel fluorescerende tag være brukbar. Denne merkingsmetoden er overlegen transgene eller antistoffmetoder. For det første, i motsetning til transgenuttrykket, opprettholder det merkede proteinet enkeltkopi-gendosering og uttrykker seg i den fysiologiske konteksten til det opprinnelige genreguleringsnettverket, og begrenser avvik i proteinkonsentrasjon, lokalisering og interaksjon. Merkingsmetoden som brukes i denne studien, oppnår over en størrelsesorden høyere gjennomstrømning og effektivitet enn full FP-merking. Det unngår også utfordringer forbundet med immunfluorescens på grunn av fikseringsartefakter og begrenset tilgjengelighet av antistoffer av høy kvalitet med høy spesifisitet. For det andre gjør tilnærmingen som brukes i dette papiret minimal forstyrrelse av cellefysiologien og muliggjør sanntids åpenbaring av alle endogene YAPs autentisk. I motsetning til dette fører andre vanlige transgene metoder ofte til overekspresjon av YAP. Den resulterende kunstige fordelingen kan potensielt forårsake cytotoksisitet og påvirke mekano-sensing av celler56,57,58.
Denne studien presenterer en protokoll for direkte å påføre kraft på kjernen gjennom magnetiske mikroperler levert inn i cytoplasma og for å gjennomføre samtidig levende celle fluorescerende bildebehandling. Oppsummert viser protokollene som presenteres her hvordan man (1) leverer magnetiske mikroperler inn i cellen mens de er utenfor kjernen, (2) manipulerer mikroperlene for å påføre magnetisk kraft på kjernen, (3) utfører konfokal fluorescerende avbildning av cellene under manipulering, og (4) kvantitativt analyserer YAP nukleær / cytoplasma (N / C) -forholdet gjennom kraftapplikasjonsprosessen. Resultatene antyder at (1) gjennom endocytose kan magnetiske mikroperler ikke-invasivt leveres inn i cytoplasmaet til B2B-celler innen 7 timer (figur 2 og figur 3); og (2) kvantifisert magnetisk kraft direkte påført kjernen (figur 4, figur 5 og figur 6) alene kan utløse forskjellige endringer av YAP N / C-forhold i CRISPR / Cas9-konstruerte B2B-celler (figur 7 og figur 8).
Internalisering av magnetiske mikroperler (seksjon 2.2) er kritisk fordi ekstracellulære mikroperler ikke kan bruke kraft direkte på kjernen. Kraftapplikasjon og avbildning (avsnitt 5.3) er kritiske trinn i dette eksperimentet, og kraften som trengs for å deformere kjernen og indusere meningsfulle biologiske konsekvenser, kan være prøveavhengig. Kraftstørrelsen i dette eksperimentet (0,8 nN og 1,4 nN) kan økes ytterligere for å utløse kjernefysisk mekano-sensing i mindre følsomme celler.
<p class="jove_cont…The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet er finansiert av UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), UFHCC Pilot Award (X. T. og Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) og UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Vi setter stor pris på de intellektuelle diskusjonene med og den tekniske støtten fra Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Nevrokirurgi), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie LS Au (Institutt for kvantitativ systemfarmakologi), Dr. David Hahn (University of Arizona), og støtteteamet til Nikon (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon og Jon Ekman). Vi er dypt takknemlige for den effektive støtten fra alle medlemmer av Tangs, Yamaguchis, Sharmas, Au’s, Siemanns og Guans forskningslaboratorier og alle ansatte i UF MAE-avdelingen.
0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
25 cm2 flask | Corning | 156340 | |
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads | N/A | N/A | |
A1R confocal system | Nikon | ||
Carbonyl Iron Powder CM | BASF | 30042253 | Magnetic microbead |
Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
Desktop Computer | Dell | with Windows 10 operating system | |
Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | ||
Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Magnet | K&J Magnetics, Inc. | D99-N52 | |
Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
NIS-Elements software platform | Nikon | software platform | |
Nucleus mask ImageJ macro | https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask | ||
NucSpot Live 650 | Biotium | #40082 | Nuclear stain |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Ti2-E inverted microscope | Nikon | ||
XYZ mover (CAD files) | https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover |