A Técnica Peel-Blot: Um Método de Preparação de Amostras Crio-EM para Separar Camadas Individuais de Amostras Biológicas Multicamadas ou Concentradas

Resumo

A técnica peel-blot é um método de preparação de grade crio-EM que permite a separação de amostras biológicas multicamadas e concentradas em camadas únicas para reduzir a espessura, aumentar a concentração da amostra e facilitar o processamento da imagem.

Resumo

A técnica de preparação de grade crio-EM peel-blot é um método de retroinjeção significativamente modificado com o objetivo de alcançar uma redução nas camadas de amostras de várias camadas. Essa remoção de camadas antes do congelamento por imersão pode ajudar a reduzir a espessura da amostra para um nível adequado para a coleta de dados crio-EM, melhorando a planicidade da amostra e facilitando o processamento da imagem. A técnica peel-blot permite a separação de membranas multilamelares em camadas únicas, de cristais 2D em camadas em cristais individuais e de estruturas empilhadas em forma de folha de proteínas solúveis para também serem separadas em camadas únicas. A alta espessura da amostra desses tipos de amostras frequentemente apresenta problemas insuperáveis para a coleta de dados crio-EM e processamento de imagem crio-EM, especialmente quando o estágio do microscópio deve ser inclinado para a coleta de dados. Além disso, grades de altas concentrações de qualquer uma dessas amostras podem ser preparadas para uma coleta de dados eficiente, uma vez que a concentração da amostra antes da preparação da grade pode ser aumentada e a técnica peel-blot ajustada para resultar em uma distribuição densa de amostra de camada única.

Introdução

A técnica peel-blot foi desenvolvida com o objetivo de separar cristais bidimensionais empilhados de proteínas de membrana em camadas únicas para obter amostras adequadamente finas para coleta de dados crio-EM 2D e 3D e facilitar o processamento de imagens¹. O protocolo é igualmente adequado para outros tipos de amostras multilamelares, bem como para alcançar altas concentrações de amostra de qualquer tipo de amostra na grade sem aumentar a espessura em Z.

A redução das camadas de amostra para uma camada é alcançada pela aplicação de uma combinação de pressão capilar e forças de cisalhamento em um protocolo que se es....

Protocolo

1. Etapas de preparação para a técnica peel-blot

NOTA: A preparação requer que os seguintes itens sejam colocados adjacentes uns aos outros.

1. Empilhe dois pedaços de papel de filtro de 20-25 μm de tamanho de poro (consulte Tabela de Materiais).
2. Coloque uma película de parafina de ~8 cm x 10 cm de comprimento adjacente ao papel de filtro com o papel voltado para cima.
3. Coloque um pedaço de papel de filtro submícron em cima de dois pedaços adicionais de papel de filtro #4 (Figura 1-1).
4. Posicione a pinça anticapilar com a pern....

Resultados

Um experimento bem-sucedido de peel-blot resultará em camadas únicas de amostras em concentrações muitas vezes altas. É de se esperar que algumas regiões na maioria dos quadrados de grade ainda contenham várias camadas, especialmente em menor número de iterações dos passos de peel-blot. A maioria dos quadrados de grade, no entanto, conterá extensas regiões de camadas únicas, como observado para cristais 2D de leucotrieno humano C₄ sintase (Figura 2) e lipossomas (adicionados na etapa 3.2

Discussão

O peel-blot é um método poderoso para superar o empilhamento e a espessura de cristais 2D de várias camadas e amostras semelhantes para coleta de dados crio-EM e processamento de imagens. Uma decisão sobre o uso do peel-blot será baseada em parâmetros biológicos da amostra e também exigirá avaliação assim que um modelo crio-EM 3D estiver disponível. A importância biológica dos contactos e a potencial flexibilidade das regiões de contacto serão particularmente importantes nesta avaliação.

O núm.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Grades de 600 mesh	SPI	2060-C-XA
Pinça anticapilar	Ted Pella	510-5
Carbono para revestir mica
Cryo-EM			As grades Cryo-EM podem ser rastreadas a 120 kV ou 200 kV.  Os dados de alta resolução são coletados a 300 kV.
Pinça Dumpont #5 Ted	Pella	5622
Caixa de grade para armazenamento crio-EM	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Mica de nitrogênio
Ted	Pella	56	A mica é revestida de carbono e cortada em quadrados que são ligeiramente maiores do que uma grade TEM.  A espessura do carbono pode exigir otimização para evitar carbono fino que se quebra facilmente após várias manchas de casca.
Mancha			1-2% de acetato de uranila é adequado para muitas amostras.  Outras manchas, como o ácido fosfotúngstico, podem ser substituídas.
parafilme
			Um contêiner de transporte de poliestireno pode ser reciclado para esse fim e forrado com papel alumínio.
Papel de filtro submicrométrico	MilliporeSigma	DAWP04700
Microscópio eletrônico de transmissão	JEOL	JEM-1400	Qualquer TEM operado a uma tensão de aceleração de 80-120 kV será adequado para triagem de grades manchadas negativamente.
Trealose			Prepare a solução de trealose a 4%.
Whatman #4 papel de filtro	MilliporeSigma	WHA1004150	Isso corresponde ao 20-25 μ papel de filtro do tamanho do poro de m no protocolo.

líquido negativa Recipiente de poliestireno Usado para vitrificar a grade de casca-borrão.