필 블롯 기법: 다층 또는 농축된 생물학적 시료에서 단층을 분리하는 Cryo-EM 시료 전처리 방법
Summary
필 블롯 기술은 다층 및 농축된 생물학적 샘플을 단일 레이어로 분리하여 두께를 줄이고 샘플 농도를 높이며 이미지 처리를 용이하게 하는 Cryo-EM 그리드 준비 방법입니다.
Abstract
필 블롯 Cryo-EM 그리드 준비 기술은 다층 시료의 층을 줄이기 위해 크게 수정된 역주입 방법입니다. 플런지 동결 전에 층을 제거하면 시료 두께를 Cryo-EM 데이터 수집에 적합한 수준으로 줄이고 시료 평탄도를 개선하며 이미지 처리를 용이하게 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 필 블롯 기술은 다층 멤브레인을 단일 층으로 분리하고, 층상 2D 결정을 개별 결정으로, 용해성 단백질의 적층 된 시트 모양의 구조를 단일 층으로 분리 할 수 있습니다. 이러한 유형의 시료의 높은 시료 두께는 특히 데이터 수집을 위해 현미경 스테이지를 기울여야 하는 경우 Cryo-EM 데이터 수집 및 Cryo-EM 이미지 처리에 극복할 수 없는 문제를 자주 제기합니다. 또한, 그리드 준비 이전의 샘플 농도를 증가시킬 수 있고 필 블롯 기술을 조정하여 단층 표본의 조밀 한 분포를 초래할 수 있기 때문에 이러한 샘플 중 임의의 고농도의 그리드를 효율적으로 데이터 수집을 위해 준비 할 수 있습니다.
Introduction
필 블롯 기술은 적층된 막 단백질의 2차원 결정을 단층으로 분리하여 Cryo-EM 2D 및 3D 데이터 수집에 적합한 얇은 샘플을 얻고이미지 처리를 용이하게 하기 위해 개발되었습니다1. 이 프로토콜은 다른 유형의 다층 샘플뿐만 아니라 Z 단위의 두께를 늘리지 않고 그리드에서 두 샘플 유형의 높은 샘플 농도를 달성하는 데에도 적합합니다.
샘플 층을 하나의 층으로 감소시키는 것은 역주입 방법(2) 상에서 실질적으로 연장되고 변형되는 프로토콜에서 모세관 압력과 전단력의 조합을 적용함으로써 달성된다. 첫 번째 블로팅 단계는 백 주입 방법에서 20-25μm 여과지 기공 크기가 아닌 서브 마이크론에서 블로팅하는 동안 다층 샘플의 양쪽에 탄소 필름과 그리드 바를 단단히 샌드위치하고 부착시킵니다. 개별 층의 분리 또는 박리는 그리드가 트레할로스 드롭에 수직으로 눌려지면 샌드위치 된 층을 강제로 분리 할 때 발생하여 탄소 필름이 그리드 막대에서 멀어집니다 (그림 1). 그리드 바와의 원래 접촉점에서 멀리 떨어진 탄소 필름의 위치 변경은 그리드가 서브 마이크론 여과지에서 다시 한번 블롯 될 때 다음 단계에서 발생합니다. 이러한 단계의 반복 횟수는 특정 샘플에 대해 최적화할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜을 사용하여 Z의 응집을 피하면서 샘플 농도를 높일 수 있습니다. 그리드 바 및 탄소 필름에 대한 부착과 강제 분리에 의존하기 때문에 이 접근법은 특정 섬세하거나 불안정한 단백질 및 단백질 복합체와 같은 매우 깨지기 쉬운 분자에는 적합하지 않을 수 있습니다.
필 블롯 기술은 특수 장비나 값비싼 소모품이 필요하지 않습니다. 그러나 특정 샘플에 대한 적용 가능성은 생물학적 매개 변수에 대한 신중한 고려가 필요합니다. 평탄도를 보장하기 위해 탄소 필름이 필요하기 때문에 2D 결정의 경우 결정이 더 쉽지만 필 블롯 기술을 통한 조작은 샘플의 생물학적 무결성 또는 결정 순서에 영향을 미칠 수 있습니다. 단일 입자에 대한 필 블롯 기술의 적합성은 탄소 필름이 필요하고 조작에 안정적인 것으로 제한되며 테스트 될 수 있습니다. 층 사이에 중요한 생물학적 상호 작용이있는 표본은 이러한 상호 작용의 중단으로 인해 필 블롯 기술의 도움으로 특성화에 적합하지 않을 수 있습니다.
필 블롯 기술(“필 블롯”)은 실온에서 TEM에 의한 음성 염색 또는 염색되지 않은 샘플로 테스트 및 스크리닝함으로써 가장 빠르게 최적화됩니다. 최적의 필 블롯 반복 횟수가 확인되면 유리화 전에 두께를 제어하는 시간을 결정할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
필 블롯은 Cryo-EM 데이터 수집 및 이미지 처리를 위해 다층 2D 결정 및 유사한 샘플의 적층 및 두께를 극복하는 강력한 방법입니다. 필 블롯 사용에 대한 결정은 샘플의 생물학적 파라미터를 기반으로 하며 3D Cryo-EM 모델을 사용할 수 있게 되면 평가도 필요합니다. 접촉의 생물학적 중요성과 접촉 영역의 잠재적 유연성은이 평가에서 특히 중요합니다.
필 블롯의 수는 처음에는 표…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업의 일부는 NIH 보조금 HL090630(ISK)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
Referências
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