Метод пилинга:метод крио-ЭМ-пробоподготовки для отделения отдельных слоев от многослойных или концентрированных биологических образцов

Summary

Метод пилинга-пятнистости представляет собой метод крио-ЭМ-подготовки сетки, который позволяет разделять многослойные и концентрированные биологические образцы на отдельные слои для уменьшения толщины, увеличения концентрации образца и облегчения обработки изображений.

Abstract

Метод подготовки крио-ЭМ-сетки с пилингом представляет собой значительно модифицированный метод обратной инъекции с целью достижения уменьшения слоев многослойных образцов. Это удаление слоев перед погружением замораживания может помочь уменьшить толщину образца до уровня, подходящего для сбора крио-ЭМ данных, улучшить плоскостность образца и облегчить обработку изображений. Метод пилинга-блоттинга позволяет разделить многоламеллярные мембраны на отдельные слои, слоистые 2D-кристаллы на отдельные кристаллы и уложенные листообразные структуры растворимых белков также быть разделенными на отдельные слои. Высокая толщина образцов этих типов образцов часто создает непреодолимые проблемы для сбора крио-ЭМ данных и крио-ЭМ обработки изображений, особенно когда ступень микроскопа должна быть наклонена для сбора данных. Кроме того, сетки с высокими концентрациями любого из этих образцов могут быть подготовлены для эффективного сбора данных, поскольку концентрация образца до подготовки сетки может быть увеличена, а метод шелушения-пятна скорректирован таким образом, чтобы привести к плотному распределению однослойного образца.

Introduction

Метод пилинга-блоттинга был разработан для того, чтобы разделить сложенные двумерные кристаллы мембранных белков на отдельные слои для получения достаточно тонких образцов для сбора крио-ЭМ 2D и 3D данных и облегчения обработки изображений¹. Протокол также подходит для других типов многоламерных образцов, а также для достижения высоких концентраций образцов любого типа образца на сетке без увеличения толщины в Z.

Уменьшение слоев образца до одного слоя достигается путем применения комбинации капиллярного давления и сил сдвига в протоколе, который существенно расширяет и модифицирует метод обратной инъекции². Первая стадия промокшивания приводит к плотному сэндвичингу и сцеплению с углеродной пленкой и сетчатой полосой по обе стороны многослойного образца во время промокания на субмикроне, а не к размеру пор фильтровальной бумаги 20-25 мкм в методе обратного впрыска. Разделение или отслаивание отдельного слоя происходит при принудительном разделении зажатых слоев после того, как сетка прижимается вертикально к трегалозной капле, выталкивая углеродную пленку от стержня сетки (рисунок 1). Перемещение углеродной пленки в сторону от исходной точки контакта с стержнем сетки происходит на следующем этапе, когда сетка снова смачивается на субмикронной фильтровальной бумаге. Количество итераций этих шагов может быть оптимизировано для конкретных образцов. Кроме того, протокол может быть использован для увеличения концентраций образцов, избегая при этом агрегации в Z. Из-за зависимости от сцепления с сетчатого стержня и углеродной пленки, а также принудительного разделения, этот подход может не подходить для очень хрупких молекул, таких как определенные деликатные и/или нестабильные белки и белковые комплексы.

Техника пилинга не требует ни специализированного оборудования, ни дорогостоящих расходных материалов. Однако применимость к конкретным образцам потребует тщательного рассмотрения биологических параметров. Решение проще для 2D-кристаллов, поскольку для обеспечения плоскостности требуется углеродная пленка, но манипуляции с помощью метода пилинга могут повлиять на биологическую целостность образца или кристаллический порядок. Пригодность метода пилинга-блоттинга к одиночным частицам ограничена и может быть проверена на те, которые требуют углеродной пленки и устойчивы к манипуляциям. Образцы с критическими биологическими взаимодействиями между слоями могут не подходить для характеристики с помощью метода пилинга-блоттинга из-за нарушения таких взаимодействий.

Метод пилинга-блоттинга («пилинг-блотт») наиболее быстро оптимизируется путем тестирования и скрининга с отрицательным пятном или неокрашенными образцами ТЭМ при комнатной температуре. После того, как оптимальное количество итераций шелушения-пятна было определено, можно определить время для контроля толщины до витрификации.

Protocol

1. Этапы подготовки к технике пилинг-блоттинг ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка требует размещения следующих предметов рядом друг с другом. Сложите два куска фильтровальной бумаги размером 20-25 мкм (см. Таблицу материалов). Поместите парафиновую пленку д…

Representative Results

Успешный эксперимент с шелушением приведет к созданию отдельных слоев образцов в часто высоких концентрациях. Следует ожидать, что некоторые области в большинстве квадратов сетки по-прежнему будут содержать несколько слоев, особенно при меньшем количестве итераций шагов отслаивания…

Discussion

Пил-блоттинг является мощным методом преодоления укладки и толщины многослойных 2D-кристаллов и аналогичных образцов для сбора крио-ЭМ данных и обработки изображений. Решение об использовании пилинга будет основываться на биологических параметрах образца, а также потребует оценки по?…

Materials

600-mesh grids	SPI	2060-C-XA
Anti-capillary forceps	Ted Pella	510-5
Carbon to coat mica
Cryo-EM			Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.  High-resolution data is collected at 300 kV.
Dumpont #5 forceps	Ted Pella	5622
Grid box for cryo-EM storage	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Liquid nitrogen
Mica	Ted Pella	56	The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.  The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.
Negative stain			1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.  Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.
Parafilm
Polystyrene container			Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.
Submicron filter paper	MilliporeSigma	DAWP04700
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-1400	Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.
Trehalose			Prepare 4% trehalose solution.
Whatman #4 filter paper	MilliporeSigma	WHA1004150	This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol.