Här tillhandahålls ett optimerat steg-för-steg-protokoll för fixering, immunfärgning och sektionering av embryon för att detektera specialiserad signalfilopodi som kallas cytonem vid utveckling av musvävnader.
Utvecklingsvävnadsmönster och postdevelopmental vävnadshomeostas beror på kontrollerad leverans av cellulära signaler som kallas morfogener. Morfogener verkar på ett koncentrations- och tidsberoende sätt för att specificera distinkta transkriptionsprogram som instruerar och förstärker cellens öde. En mekanism genom vilken lämpliga morfogensignaltrösklar säkerställs är genom leverans av signalproteinerna med specialiserade filofodier som kallas cytonem. Cytonem är mycket tunna (≤200 nm i diameter) och kan växa till längder på flera hundra mikron, vilket gör deras bevarande för fast bildanalys utmanande. Denna artikel beskriver en förfinad metod för känslig hantering av musembryon för fixering, immunfärgning och tjock sektionering för att möjliggöra visualisering av cytoniner med hjälp av standard konfokalmikroskopi. Detta protokoll har framgångsrikt använts för att visualisera cytonem som ansluter distinkta cellulära signalfack under utveckling av neuralrör hos mus. Tekniken kan också anpassas för att detektera cytonem över vävnadstyper för att underlätta förhör av utvecklingssignalering med oöverträffad upplösning.
Embryonal utveckling orkestreras genom samordnad aktivering av morfogensignaleringsvägar. Morfogener är små, utsöndrade proteiner som kategoriseras i Sonic Hedgehog (SHH), som omvandlar tillväxtfaktor β (TGF-β) / benmorfogent protein (BMP), Wingless-relaterat integrationsställe (WNT) och fibroblast och epidermal tillväxtfaktor (FGF / EGF) familjer. Morfogener produceras och frigörs från cellulära organiseringscentra under vävnadsutveckling och etablerar signalgradienter över organiserande fält av celler för att informera vävnadsmorfogenes 1,2,3,4,5. En representation av morfogengradienter finns i det utvecklande nervsystemet, där det presumtiva centrala nervsystemet mönstras genom morfogenvägsaktivering. Denna vävnad, kallad neuralröret, består av motsatta gradienter av SHH som utsöndras av den ventrala mest notokord- och golvplattan, och WNTs / BMP utsöndras från dorsala takplattan, för att mönstra distinkta neurala stamfaderregioner6. Neuralröret används ofta för att förhöra morfogengradientintegritet i utvecklingsforskning.
Morfogengradientbildning är beroende av tät reglering av signaldispersion7. En cellulär mekanism genom vilken detta sker är genom bildandet av långa signalerande filofodier som kallas cytonem som underlättar direkt leverans av morfogener från signalproducerande celler till specifika målcellpopulationer. Cytonem har observerats sträcka sig hundratals mikrometer för att deponera morfogener på signalmottagande cellmembran 8,9. Störning av cytonemmedierad morfogentransport leder till utvecklingsavvikelser hos både flugor och ryggradsdjur, vilket belyser deras betydelse under vävnadsmönster 10,11,12,13,14.
Hittills har cytonem dokumenterats i Drosophila-, kyckling- och zebrafiskmodeller, men avbildning av strukturerna vid utveckling av däggdjursembryon är fortfarande utmanande 8,9,15. Ett hinder för att effektivt avbilda cytonem i komplexa däggdjursvävnader in situ är deras tunna och ömtåliga natur, vilket gör dem mottagliga för skador med konventionella fixeringsmetoder8. Vi hade tidigare utvecklat och optimerat protokoll för ett modifierat elektronmikroskopifixativ (MEM-fix) för att bevara cytonem i odlade celler och möjliggöra deras studie med konfokalmikroskopi16,17.
Användning av MEM-fix-tekniken har möjliggjort identifiering av några av de molekyler som är involverade i SHH-inducerad cytonembildning och funktion 11,16,17. Bekräftelse av dessa fynd i det fysiologiskt relevanta sammanhanget för neuralrörsmönster krävde dock utveckling av nya tekniker för att fixera och avbilda musembryonvävnad. Ett protokoll för att fixera musembryon på ett sätt som upprätthåller cytonemintegritet och tillåter immunfärgning och efterföljande sektionering av embryonal vävnad för konfokal analys beskrivs här. Detta protokoll utvecklades med hjälp av ett membranbundet grönt fluorescerande protein (GFP) för att märka membranförlängningar från de SHH-producerande cellerna i det utvecklande neuralröret. Genomförandet av detta protokoll kommer att ta itu med obesvarade frågor som rör förekomsten och betydelsen av cytonem vid utveckling av däggdjurssystem.
Detta protokoll utvecklades för bevarande av känsliga cytonem i embryonala vävnadssektioner för högupplöst fluorescensmikroskopi. Hittills har visualisering av cytonem i vävnad över olika modellorganismer till stor del förlitat sig på ektopiskt uttryck av fluorescerande märkta proteiner med hjälp av levande vävnadsavbildning. Tyvärr bidrar användningen av fluorescerande märkt levande avbildning sällan till analysen av endogent uttryckta proteiner, kan införa tidsbegränsningar och kräver specialiserade bildsteg och mikroskop. Färgnings- och sektioneringsmetoden som beskrivs här bevarar cytonem och andra cellulära förlängningar för att möjliggöra immunohistokemi för eventuell detektion av endogent uttryckta proteiner. Denna teknik kommer att underlätta nya insikter om hur morfogener transporteras över olika vävnader in vivo och utvidgar omfattningen av modellsystem där cytonem kan studeras.
Detta protokoll använder helmonterad färgning och vibratom tjocksnittning, vilket undviker användning av jämviktslösning såsom glycerol eller kryoskyddande lösningar såsom sackaros. Det syftar till att minimera hanteringen av sektionerad vävnad för att möjliggöra maximalt bevarande av cellulära förlängningar. Minskad hantering av vävnaden efter sektionering gav konsekvent bättre resultat i den totala bevarandet av cytonem. Således är sektionering av embryot ett av de sista stegen före avbildning.
MEM-fix, en fixeringsteknik utvecklad för bevarande av cytonem hos odlade celler, består av en kombination av glutaraldehyd och PFA som möjliggör förbättrad 3D-bevarande av den medfödda cellarkitekturen jämförbar med deras levande dimensioner16,17. Tyvärr var MEM-fix inte användbart för embryofixering eftersom glutaraldehyd kan autofluorescera och allvarligt begränsar antikroppspenetration och epitopbindning i celler på grund av hög proteinkorsbindningsaktivitet22,23. Således optimerades sektioneringsprotokoll efter PFA-fixeringsförhållanden för att möjliggöra bevarande av cellulära förlängningar i embryonal vävnad. Även om PFA kan bevara cytonemliknande förlängningar i embryonal vävnad, bör bildanalys utföras med försiktighet. PFA kan orsaka partiell uttorkning av enskilda celler och vävnader, vilket leder till mindre volymreduktion och bildandet av små extracellulära utrymmen i den fasta vävnaden.
Detta protokoll undviker de extra stegen av sackarosåterhämtning för kryoskydd och vävnadsrensning eftersom sackaros- eller glycerollösningar kan orsaka en mindre returation av vävnaden24. Den resulterande mindre svullnaden kan förstöra fasta cellulära förlängningar och cytonem som migrerar mellan celler och över vävnader. Detta var uppenbart när man jämförde tjocksektionerad vibratom med kryostatsektioner. Även om ökande vävnadstjocklek förbättrade bevarandet av intakta cytonem, hade de sackaros-reproterade kryostatsektionerna konsekvent en lägre förekomst av detekterbara cytonem.
Optimering av detta protokoll avslöjade att 100 μm tjocka sektioner var det bästa för att säkerställa bevarande av intakta cytonem. Tunnare sektioner används vanligtvis för avbildning eftersom de flesta konfokalmikroskop endast kan avbildas med tillräcklig upplösning för att visualisera cellulära förlängningar till ett djup av ~ 20-40 μm utan att rensa25. De mekaniska krafterna och förvrängningen som appliceras på embryonala celler från bladet medan man skär tunna sektioner förstör emellertid cytonem. Tjockare sektioner möjliggör ett större djupområde inom sektionen samtidigt som intakta förlängningar i vävnaden bevaras. Dessutom möjliggör användningen av tjockare sektioner enkel hantering för att förhindra överdriven vikning eller buckling av vävnadssektionerna.
Detta protokoll optimerades för maximal bevarande av cytonem i vävnad av E8-10,5 musembryon. Minimal manipulation av vävnaden efter sektionering gav konsekvent förbättrad övergripande bevarande av cytonem. Det är troligt att ytterligare optimering kommer att krävas för att anpassa tekniken för senare utvecklingsstadier och vuxna vävnadssektioner på grund av ökad storlek och vävnadskomplexitet. Detta kommer att kräva sektionering följt av immunofluorescensfärgning. Sådan vävnad kan kräva ytterligare clearingsteg och anpassning av vävnadshantering under sektionering för att bevara cytonemliknande förlängningar. Dessa ytterligare steg måste övervägas och åtgärdas för framtida tillämpningar av detta protokoll.
The authors have nothing to disclose.
Bilder förvärvades med hjälp av mikroskop som underhålls av Cell and Molecular Biology Imaging Core vid St. Jude Children’s Research Hospital. Musstammar erhölls från JAX. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidrag R35GM122546 (SKO) och av ALSAC från St. Jude Children’s Research Hospital.
12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
Super Glue | Gorilla | ||
SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |