En simpel benchtop filtreringsmetode til isolering af små ekstracellulære vesikler fra humane mesenkymale stamceller

Summary

Denne protokol demonstrerer, hvordan man isolerer humane navlestrengsafledte mesenkymale stamcellers små ekstracellulære vesikler (hUC-MSC-sEV’er) med en simpel bænkindstilling i laboratorieskala. Størrelsesfordelingen, proteinkoncentrationen, sEVs markører og morfologi af isolerede hUC-MSC-sEV’er er karakteriseret ved henholdsvis nanopartikelsporingsanalyse, BCA-proteinanalyse, western blot, og transmissionselektronmikroskop.

Abstract

Den ultracentrifugeringsbaserede proces betragtes som den almindelige metode til isolering af små ekstracellulære vesikler (sEV’er). Udbyttet fra denne isolationsmetode er imidlertid relativt lavere, og disse metoder er ineffektive til at adskille sEV-undertyper. Denne undersøgelse demonstrerer en simpel benchtop-filtreringsmetode til isolering af humane navlestrengsafledte MSC små ekstracellulære vesikler (hUC-MSC-sEV’er), der med succes adskilles ved ultrafiltrering fra det konditionerede medium af hUC-MSC’er. Størrelsesfordelingen, proteinkoncentrationen, eksosomale markører (CD9, CD81, TSG101) og morfologien af de isolerede hUC-MSC-sEV’er blev karakteriseret med henholdsvis nanopartikelsporingsanalyse, BCA-proteinanalyse, western blot, og transmissionselektronmikroskop. De isolerede hUC-MSC-sEV’er var 30-200 nm med en partikelkoncentration på 7,75 × 10 10 partikler/ml og en proteinkoncentration på⁸⁰ μg/ml. Positive bånd for exosomale markører CD9, CD81 og TSG101 blev observeret. Denne undersøgelse viste, at hUC-MSC-sEV’er med succes blev isoleret fra hUC-MSC’s konditionerede medium, og karakterisering viste, at det isolerede produkt opfyldte kriterierne nævnt af Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

Introduction

Ifølge MISEV 2018 er sEV’er ikke-replikerende lipid-dobbeltlagspartikler uden funktionel kerne til stede med en størrelse på 30-200 nm¹. MSC-afledte sEV’er indeholder vigtige signalmolekyler, der spiller vigtige roller i vævsregenerering, såsom mikroRNA, cytokiner eller proteiner. De er i stigende grad blevet et forsknings “hotspot” inden for regenerativ medicin og cellefri terapi. Mange undersøgelser har vist, at MSC-afledte sEV’er er lige så effektive som MSC’er til behandling af forskellige tilstande, såsom immunmodulation 2,3,4,5, forbedring af osteogenese ⁶, diabetes mellitus^7,8 eller vaskulær regenerering ^9,10. Efterhånden som de tidlige faseforsøg skrider frem, er tre hovednøglespørgsmål i forbindelse med den kliniske oversættelse af MSC’er-EV’er blevet fremhævet: udbyttet af EV’erne, EV’ernes renhed (fri for celleaffald og andre biologiske forurenende stoffer såsom protein og cytokiner) og integriteten af EV’ernes phospholipid-dobbeltlagsmembran efter isolering.

Der er udviklet forskellige metoder til isolering af sEV’er ved at udnytte densiteten, formen, størrelsen og overfladeproteinet i sEV’erne¹¹. De to mest almindelige metoder i sEVs isolationer er ultracentrifugeringsbaserede og ultrafiltreringsbaserede teknikker.

Ultracentrifugeringsbaserede metoder betragtes som guldstandardmetoder i sEVs isolering. To typer ultracentrifugeringsteknikker, der normalt anvendes, er differentiel ultracentrifugering og densitetsgradient ultracentrifugering. Imidlertid resulterer ultracentrifugeringsmetoder ofte i lavt udbytte og kræver dyrt udstyr til højhastighedsultracentrifuge (100.000-200.000 × g)¹¹. Desuden er ultracentrifugeringsteknikker alene ineffektive til at adskille EV-undertyper (sEV’er og store EV’er), hvilket resulterer i et urent sedimentlag¹¹. Endelig kan densitetsgradientultracentrifugering også være tidskrævende og kræve yderligere forsigtighedstrin såsom tilsætning af saccharosebuffer for at hæmme gradientskaden under accelerations- og decelerationstrin¹². Derfor fører ultracentrifugering normalt til et relativt lavt udbytte og er ikke i stand til at skelne mellem forskellige populationer af elektriske køretøjer¹³, hvilket begrænser dets anvendelse til forberedelse af elektriske køretøjer i stor skala¹¹.

Den anden metode til EV-isolering er via ultrafiltrering, som er baseret på størrelsesfiltrering. Ultrafiltrering er relativt tids- og omkostningseffektiv sammenlignet med ultracentrifugering, da det ikke involverer dyrt udstyr eller lange behandlingstider¹⁴. Derfor synes ultrafiltrering at være en mere effektiv isolationsteknik end begge ovennævnte ultracentrifugeringsmetoder. De isolerede produkter kan være mere specifikke baseret på porestørrelser og højere udbytte¹⁵. Den ekstra kraft, der opstår under filtreringsprocessen, kan imidlertid resultere i deformation eller udbrud af elbilerne¹⁶.

Det nuværende papir foreslog en omkostnings- og tidseffektiv benchtop-protokol til isolering af MSC-afledte sEV’er til downstream-analyse og terapeutiske formål. Metoden beskrevet i dette papir kombinerede en simpel filtreringsmetode med bænkcentrifugering for at isolere højtydende elbiler af god kvalitet fra hUC-MSC’er til downstream-analyse, herunder partikelstørrelsesanalyse, biomarkøranalyse og elektronmikroskopisk billeddannelse.

Protocol

BEMÆRK: Se materialefortegnelsen for detaljer om alle materialer, udstyr og software, der bruges i denne protokol. 1. Humane navlesnorsmesenkymale stamceller og kultur Dyrk hUC-MSC’erne med en såtæthed på 5 × 103/cm2 i DMEM, suppleret med 8% humant trombocytlysat og 1% pen-strep. Cellerne inkuberes ved 37 °C i 5% CO2. Udskift cellekulturmediet hver 3. dag for at sikre korrekt cellevækst. Udvid cellern…

Representative Results

Figur 2 viser, at hUC-MSC-sEV’er har en partikelstørrelsestilstand ved 53 nm, mens andre signifikante toppe af partikelstørrelse var 96 og 115 nm. Koncentrationen af hUC-MSC-sEV’er målt ved NTA var 7,75 × 1010 partikler/ml. Proteinkoncentrationen af hUC-MSC-sEV’er målt med BCA-analysen var ca. 80 μg/ml. I western blotting-analyse viste hUC-MSC-sEV’er positive bånd for exosomale markører CD9, CD81 og TSG101, men var negative for GRP94 (<strong cl…

Discussion

EV’er er en af de vigtige delmængder af sekretomet i MSC’er, der spiller en afgørende rolle under normale og patologiske processer. Imidlertid er sEV’er med et størrelsesinterval mellem 30 og 200 nm steget som et potentielt værktøj til cellefri terapi i det sidste årti. Der blev udviklet forskellige teknikker til at isolere elbiler fra MSC’er. Imidlertid har differentiel ultracentrifugering, ultrafiltrering, polymerbaseret udfældning, immunoaffinitetsindfangning og mikrofluidikbaseret udfældning forskellige forde…

Materials

40% acrylamide	Nacalai Tesque	06121-95	Western blot
95% ethanol	Nacalai Tesque	14710-25	Disinfectants
Absolute Methanol	Chemiz	45081	To activate PVDF membrane (Western blot)
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Cell dissociation enzyme
ammonium persulfate	Chemiz	14475	catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis
anti-CD 81 (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	Antibody for sEVs marker
anti-TSG 101 (C-2)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7964	Antibody for sEVs marker
Bovine serum albumin	Nacalai Tesque	00653-31	PVDF membrane blocking
bromophenol blue	Nacalai Tesque	05808-61	electrophoretic color marker
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)	Millipore	UFC710008	sEVs isolation
ChemiLumi One L	Nacalai Tesque	7880	chemiluminescence detection reagent
CryoStor Freezing Media	Sigma-Aldrich	C3124-100ML	Cell cryopreserve
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Nacalai Tesque	08458-45	Cell culture media
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker	SMOBIO	PM2610	Protein molecular weight markers
Extra thick blotting paper	ATTO		buffer reservior (Western blot)
Glycerol	Merck	G5516	Chemicals for western blot
Glycine	1st Base	BIO-2085-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP)	Santa Cruz Biotechnology	sc-516102	Secondary antibody (Western Blot)
Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118	Antibody for sEVs marker
Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2	Malvern Panalytical, UK
paraformaldehyde	Nacalai Tesque	02890-45	Sample Fixation during TEM
penicillin–streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Antibiotic for media
phenylmethylsulfonyl fluoride	Nacalai Tesque	27327-81	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Washing, sample dilution
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size	ATTO		To hold protein during protein transfer (Western blot)
protease inhibitor cocktail	Nacalai Tesque	25955-11	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
Protein Assay Bicinchoninate Kit	Nacalai Tesque	06385-00	Protein measurement
sample buffer solution with 2-ME	Nacalai Tesque	30566-22	Reducing agent for western blot
sodium chloride	Nacalai Tesque	15266-64	Chemicals for western blot
sodium dodecyl sulfate	Nacalai Tesque	31606-62	ionic surfactant during gel electrophoresis
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope	FEI, USA
tetramethylethylenediamine	Nacalai Tesque	33401-72	chemicals to prepare gel
tris-base	1st Base	BIO-1400-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
Tween 20	GeneTex	GTX30962	Chemicals for western blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD imager			CCD imager for western blot signal detection