Dit protocol laat zien hoe de kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV’s) van menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kunnen worden geïsoleerd met een eenvoudige benchtop-instelling op laboratoriumschaal. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, sEV-markers en morfologie van geïsoleerde hUC-MSC-sEV’s worden gekenmerkt door respectievelijk nanodeeltjestrackinganalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop.
Het op ultracentrifugatie gebaseerde proces wordt beschouwd als de gebruikelijke methode voor isolatie van kleine extracellulaire blaasjes (sEV’s). De opbrengst van deze isolatiemethode is echter relatief lager en deze methoden zijn inefficiënt in het scheiden van sEV-subtypen. Deze studie demonstreert een eenvoudige benchtopfiltratiemethode om van menselijke navelstreng afgeleide MSC kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV’s) te isoleren, met succes gescheiden door ultrafiltratie van het geconditioneerde medium van hUC-MSCs. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, exosomale markers (CD9, CD81, TSG101) en morfologie van de geïsoleerde hUC-MSC-sEV’s werden gekarakteriseerd met respectievelijk nanodeeltjestraceringsanalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop. De grootte van de geïsoleerde hUC-MSC-sEV’s was 30-200 nm, met een deeltjesconcentratie van 7,75 × 10 10 deeltjes / ml en een eiwitconcentratie van80 μg / ml. Positieve banden voor exosomale markers CD9, CD81 en TSG101 werden waargenomen. Deze studie toonde aan dat hUC-MSC-sEV’s met succes werden geïsoleerd uit hUC-MSCs geconditioneerd medium, en karakterisering toonde aan dat het geïsoleerde product voldeed aan de criteria vermeld in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).
Volgens MISEV 2018 zijn sEV’s niet-replicerende lipide dubbellaagse deeltjes zonder functionele kern, met een grootte van 30-200 nm1. MSC-afgeleide sEV’s bevatten belangrijke signaalmoleculen die een belangrijke rol spelen bij weefselregeneratie, zoals microRNA, cytokines of eiwitten. Ze zijn in toenemende mate een “hotspot” voor onderzoek geworden in regeneratieve geneeskunde en celvrije therapie. Veel studies hebben aangetoond dat MSC-afgeleide sEV’s net zo effectief zijn als MSC’s bij de behandeling van verschillende aandoeningen, zoals immunomodulatie 2,3,4,5, het verbeteren van osteogenese 6, diabetes mellitus7,8 of vasculaire regeneratie 9,10. Naarmate de vroege fase van de proeven vordert, zijn drie belangrijke belangrijke kwesties met betrekking tot de klinische vertaling van MSC’s-EV’s benadrukt: de opbrengst van de EV’s, de zuiverheid van de EV’s (vrij van celresten en andere biologische verontreinigingen zoals eiwitten en cytokines) en de integriteit van het fosfolipide dubbellaagse membraan van de EV’s na isolatie.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om sEV’s te isoleren, waarbij gebruik wordt gemaakt van de dichtheid, vorm, grootte en oppervlakte-eiwit van de sEV’s11. De twee meest voorkomende methoden in sEV-isolaties zijn op ultracentrifugatie gebaseerde en op ultrafiltratie gebaseerde technieken.
Op ultracentrifugatie gebaseerde methoden worden beschouwd als gouden standaardmethoden in sEV-isolatie. Twee soorten ultracentrifugatietechnieken die meestal worden gebruikt, zijn differentiële ultracentrifugatie en dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. Ultracentrifugatiemethoden resulteren echter vaak in een lage opbrengst en vereisen dure apparatuur voor ultracentrifuge met hoge snelheid (100.000-200.000 × g)11. Bovendien zijn ultracentrifugatietechnieken alleen inefficiënt in het scheiden van EV-subtypen (sEV’s en grote EV’s), wat resulteert in een onzuivere sedimentlaag11. Ten slotte kan ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt ook tijdrovend zijn en aanvullende voorzorgsmaatregelen vereisen, zoals toevoeging van sucrosebuffer om de gradiëntschade tijdens versnellings- en vertragingsstappente remmen 12. Daarom leidt ultracentrifugatie meestal tot een relatief lage opbrengst en is het niet in staat om onderscheid te maken tussen verschillende populaties EV’s13, wat de toepassing ervan voor grootschalige EV-preparatenbeperkt 11.
De tweede methode van EV-isolatie is via ultrafiltratie, die is gebaseerd op groottefiltratie. Ultrafiltratie is relatief tijd- en kosteneffectief in vergelijking met ultracentrifugatie, omdat het geen dure apparatuur of lange verwerkingstijden met zich meebrengt14. Ultrafiltratie lijkt dus een effectievere isolatietechniek dan beide bovengenoemde ultracentrifugatiemethoden. De geïsoleerde producten kunnen specifieker zijn op basis van poriegroottes en hogere opbrengst15. De extra kracht die tijdens het filtratieproces wordt opgelopen, kan echter leiden tot de vervorming of uitbarsting van de EV’s16.
De huidige paper stelde een kosten- en tijdseffectief benchtop-protocol voor het isoleren van MSC-afgeleide sEV’s voor downstream-analyse en therapeutische doeleinden. De methode die in dit artikel wordt beschreven, combineerde een eenvoudige filtratiemethode met bench-top centrifugatie om hoogrenderende en kwalitatief goede EV’s te isoleren van hUC-MSCs voor downstream-analyse, inclusief deeltjesgrootteanalyse, biomarkertest en elektronenmicroscopische beeldvorming.
EV’s zijn een van de belangrijke subsets van het secretoom in MSC’s die een cruciale rol spelen tijdens normale en pathologische processen. Echter, sEV’s, met een groottebereik tussen 30 en 200 nm, zijn het afgelopen decennium gestegen als een potentieel hulpmiddel voor celvrije therapie. Er werden verschillende technieken ontwikkeld om sEV’s te isoleren van MSC’s. Differentiële ultracentrifugatie, ultrafiltratie, precipitatie op basis van polymeren, immunoaffiniteitsafvang en op microfluïdica gebaseerde precipitatie h…
The authors have nothing to disclose.
De publicatie van deze video werd ondersteund door My CytoHealth Sdn. Bhd.
40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |