En enkel stasjonær filtreringsmetode for å isolere små ekstracellulære vesikler fra humane mesenkymale stamceller

Summary

Denne protokollen demonstrerer hvordan man isolerer humane navlestrengsavledede mesenkymale stamcellers små ekstracellulære vesikler (hUC-MSC-sEVs) med en enkel benkeplateinnstilling i laboratorieskala. Størrelsesfordelingen, proteinkonsentrasjonen, sEVs markører og morfologi av isolerte hUC-MSC-sEVs er preget av henholdsvis nanopartikkelsporingsanalyse, BCA-proteinanalyse, western blot og transmisjonselektronmikroskop.

Abstract

Den ultrasentrifugeringsbaserte prosessen regnes som den vanlige metoden for isolasjon av små ekstracellulære vesikler (sEVs). Utbyttet fra denne isolasjonsmetoden er imidlertid relativt lavere, og disse metodene er ineffektive for å skille sEV-undertyper. Denne studien demonstrerer en enkel stasjonær filtreringsmetode for å isolere MSC små ekstracellulære vesikler (hUC-MSC-sEVs) fra mennesker, vellykket separert ved ultrafiltrering fra det kondisjonerte mediet til hUC-MSC. Størrelsesfordelingen, proteinkonsentrasjonen, eksosomale markører (CD9, CD81, TSG101) og morfologien til de isolerte hUC-MSC-sEVene ble karakterisert med henholdsvis nanopartikkelsporingsanalyse, BCA-proteinanalyse, western blot og transmisjonselektronmikroskop. De isolerte hUC-MSC-sEVs størrelse var 30-200 nm, med en partikkelkonsentrasjon på 7,75 × 10 10 partikler/ml og en proteinkonsentrasjon på⁸⁰ μg/ml. Positive bånd for eksosomale markører CD9, CD81 og TSG101 ble observert. Denne studien viste at hUC-MSC-sEVs ble vellykket isolert fra hUC-MSCs betingede medium, og karakterisering viste at det isolerte produktet oppfylte kriteriene nevnt av Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

Introduction

I følge MISEV 2018 er sEV ikke-replikerende lipid-dobbeltlagspartikler uten funksjonell kjerne tilstede, med en størrelse på 30-200 nm¹. MSC-avledede sEV-er inneholder viktige signalmolekyler som spiller viktige roller i vevregenerering, for eksempel mikroRNA, cytokiner eller proteiner. De har i økende grad blitt et forsknings-“hotspot” innen regenerativ medisin og cellefri terapi. Mange studier har vist at MSC-avledede sEV-er er like effektive som MSC ved behandling av forskjellige forhold, for eksempel immunmodulering 2,3,4,5, forsterkende osteogenese ⁶, diabetes mellitus ^7,8 eller vaskulær regenerering ^9,10. Etter hvert som forsøkene i tidlig fase skrider frem, har tre hovednøkkelspørsmål i forhold til den kliniske oversettelsen av MSC-EV-er blitt fremhevet: utbyttet av elbilene, renheten til elbilene (fri for cellerester og andre biologiske forurensninger som protein og cytokiner) og integriteten til fosfolipid-dobbeltlagsmembranen til elbilene etter isolering.

Ulike metoder har blitt utviklet for å isolere sEVs, utnytte tettheten, formen, størrelsen og overflateproteinet til sEVs¹¹. De to vanligste metodene i sEV-isolasjoner er ultrasentrifugeringsbaserte og ultrafiltreringsbaserte teknikker.

Ultrasentrifugeringsbaserte metoder regnes som gullstandardmetoder i sEVs isolasjon. To typer ultracentrifugation teknikker som vanligvis brukes er differensiell ultracentrifugation og tetthet gradient ultracentrifugation. Imidlertid resulterer ultrasentrifugeringsmetoder ofte i lavt utbytte og krever dyrt utstyr for høyhastighets ultrasentrifuge (100.000-200.000 × g)¹¹. Videre er ultrasentrifugeringsteknikker alene ineffektive for å separere EV-subtyper (sEV og store EV), noe som resulterer i et urent sedimentlag¹¹. Til slutt kan ultrasentrifugering av tetthetsgradient også være tidkrevende og kreve ytterligere forholdsregler som sukrosebuffertillegg for å hemme gradientskaden under akselerasjon og retardasjonstrinn¹². Derfor fører ultrasentrifugering vanligvis til et relativt lavt utbytte og er ikke i stand til å diskriminere mellom forskjellige populasjoner av EV¹³, noe som begrenser søknaden om storskala EV-forberedelse¹¹.

Den andre metoden for EV-isolasjon er via ultrafiltrering, som er basert på størrelsesfiltrering. Ultrafiltrering er relativt tids- og kostnadseffektivt sammenlignet med ultrasentrifugering, da det ikke innebærer dyrt utstyr eller lang saksbehandlingstid¹⁴. Derfor synes ultrafiltrering å være en mer effektiv isolasjonsteknikk enn begge de nevnte ultrasentrifugeringsmetodene. De isolerte produktene kan være mer spesifikke basert på porestørrelser og høyere utbytte¹⁵. Den ekstra kraften som påløper under filtreringsprosessen kan imidlertid føre til deformasjon eller utbrudd av elbilene¹⁶.

Det nåværende papiret foreslo en kostnads- og tidseffektiv benchtop-protokoll for isolering av MSC-avledede sEV-er for nedstrømsanalyse og terapeutiske formål. Metoden beskrevet i dette papiret kombinerte en enkel filtreringsmetode med benksentrifugering for å isolere høy avkastning og god kvalitet EV fra hUC-MSCs for nedstrømsanalyse, inkludert partikkelstørrelsesanalyse, biomarkøranalyse og elektronmikroskopisk avbildning.

Protocol

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen. 1. Human navlestreng, mesenkymale stamceller og kultur Dyrkning av hUC-MSC ved en såtetthet på 5 × 103/cm2 i DMEM, supplert med 8 % humant blodplatelysat og 1 % pen-streptokokker. Inkuber cellene ved 37 °C i 5% CO2. Bytt ut cellekulturmediet hver 3. dag for å sikre riktig cellevekst. Utvi…

Representative Results

Figur 2 viser at hUC-MSC-sEV har en partikkelstørrelsesmodus ved 53 nm, mens andre signifikante topper av partikkelstørrelse var 96 og 115 nm. Konsentrasjonen av hUC-MSC-sEVs målt av NTA var 7,75 × 1010 partikler/ml. Proteinkonsentrasjonen av hUC-MSC-sEVs målt med BCA-analysen var ca. 80 μg / ml. I vestlig blottinganalyse viste hUC-MSC-sEV positive bånd for eksosommarkørene CD9, CD81 og TSG101, men var negative for GRP94 (fi…

Discussion

Elbiler er en av de viktige undergruppene av sekretomet i MSC som spiller en avgjørende rolle under normale og patologiske prosesser. Imidlertid har sEV, med et størrelsesområde mellom 30 og 200 nm, steget som et potensielt verktøy for cellefri terapi det siste tiåret. Ulike teknikker ble utviklet for å isolere sEV-er fra MSC-er. Imidlertid har differensiell ultrasentrifugering, ultrafiltrering, polymerbasert nedbør, immunoaffinitetsfangst og mikrofluidikkbasert nedbør forskjellige fordeler og ulemper<sup class="…

Materials

40% acrylamide	Nacalai Tesque	06121-95	Western blot
95% ethanol	Nacalai Tesque	14710-25	Disinfectants
Absolute Methanol	Chemiz	45081	To activate PVDF membrane (Western blot)
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Cell dissociation enzyme
ammonium persulfate	Chemiz	14475	catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis
anti-CD 81 (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	Antibody for sEVs marker
anti-TSG 101 (C-2)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7964	Antibody for sEVs marker
Bovine serum albumin	Nacalai Tesque	00653-31	PVDF membrane blocking
bromophenol blue	Nacalai Tesque	05808-61	electrophoretic color marker
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)	Millipore	UFC710008	sEVs isolation
ChemiLumi One L	Nacalai Tesque	7880	chemiluminescence detection reagent
CryoStor Freezing Media	Sigma-Aldrich	C3124-100ML	Cell cryopreserve
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Nacalai Tesque	08458-45	Cell culture media
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker	SMOBIO	PM2610	Protein molecular weight markers
Extra thick blotting paper	ATTO		buffer reservior (Western blot)
Glycerol	Merck	G5516	Chemicals for western blot
Glycine	1st Base	BIO-2085-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP)	Santa Cruz Biotechnology	sc-516102	Secondary antibody (Western Blot)
Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118	Antibody for sEVs marker
Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2	Malvern Panalytical, UK
paraformaldehyde	Nacalai Tesque	02890-45	Sample Fixation during TEM
penicillin–streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Antibiotic for media
phenylmethylsulfonyl fluoride	Nacalai Tesque	27327-81	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Washing, sample dilution
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size	ATTO		To hold protein during protein transfer (Western blot)
protease inhibitor cocktail	Nacalai Tesque	25955-11	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
Protein Assay Bicinchoninate Kit	Nacalai Tesque	06385-00	Protein measurement
sample buffer solution with 2-ME	Nacalai Tesque	30566-22	Reducing agent for western blot
sodium chloride	Nacalai Tesque	15266-64	Chemicals for western blot
sodium dodecyl sulfate	Nacalai Tesque	31606-62	ionic surfactant during gel electrophoresis
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope	FEI, USA
tetramethylethylenediamine	Nacalai Tesque	33401-72	chemicals to prepare gel
tris-base	1st Base	BIO-1400-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
Tween 20	GeneTex	GTX30962	Chemicals for western blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD imager			CCD imager for western blot signal detection