Este protocolo demonstra como isolar pequenas vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs) com uma configuração simples de bancada em escala laboratorial. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores de sEVs e morfologia de hUC-MSC-sEVs isolados são caracterizados por análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente.
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Artigo de método
Um Método Simples de Filtração de Bancada para Isolar Pequenas Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Humanas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O processo baseado em ultracentrifugação é considerado o método comum para o isolamento de pequenas vesículas extracelulares (EVs). No entanto, o rendimento desse método de isolamento é relativamente menor, e esses métodos são ineficientes na separação dos subtipos de sEV. Este estudo demonstra um método simples de filtração de bancada para isolar pequenas vesículas extracelulares de CTM derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs), separadas com sucesso por ultrafiltração do meio condicionado de hUC-MSCs. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores exossômicos (CD9, CD81, TSG101) e morfologia dos hUC-MSC-sEVs isolados foram caracterizados com análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente. O tamanho das hUC-MSC-sEVs isoladas foi de 30-200 nm, com concentração de partículas de 7,75 × 10 10 partículas/mL e concentração proteica de80 μg/mL. Bandas positivas para os marcadores exossômicos CD9, CD81 e TSG101 foram observadas. Este estudo mostrou que hUC-MSC-sEVs foram isolados com sucesso do meio condicionado hUC-MSCs, e a caracterização mostrou que o produto isolado preencheu os critérios mencionados pelo Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).
Introdução
De acordo com o MISEV 2018, sEVs são partículas de bicamada lipídica não replicantes sem núcleo funcional presente, com um tamanho de 30-200 nm1. Os sEVs derivados de CTM contêm moléculas sinalizadoras importantes que desempenham papéis importantes na regeneração tecidual, como microRNA, citocinas ou proteínas. Eles têm se tornado cada vez mais um "hotspot" de pesquisa em medicina regenerativa e terapia livre de células. Muitos estudos têm demonstrado que as EVs derivadas das CTM são tão eficazes quanto as CTMs no tratamento de diferentes condições, como imunomodulação2,3,4,5, potencialização da osteogênese6
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Protocolo
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, equipamentos e software usados neste protocolo.
1. Células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano e cultura
- Cultivar as CTMs-hUC na densidade de semeadura de 5 × 103/cm2 em DMEM, suplementada com 8% de lisado plaquetário humano e 1% de caneta-Strep. Incubar as células a 37 °C em 5% de CO2. Substitua o meio de cultura celular a cada 3 dias para garantir o crescimento celular adequado.
- Expandir as células para a passagem 5 em frascos T175 para isolamento de sEV.
NO....
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Resultados
A Figura 2 mostra que hUC-MSC-sEVs têm um modo de tamanho de partícula em 53 nm, enquanto outros picos significativos de tamanho de partícula foram 96 e 115 nm. A concentração de hUC-MSC-sEVs medida por NTA foi de 7,75 × 1010 partículas/mL. A concentração proteica de hUC-MSC-sEVs medida com o ensaio de BCA foi de aproximadamente 80 μg/mL.
Na análise de western blotting, hUC-MSC-sEVs demonstraram bandas positivas para os marcadores exossômicos CD9, CD81 .......
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Discussão
Os EVs são um dos subgrupos importantes do secretoma nas CTMs que desempenham um papel crucial durante processos normais e patológicos. No entanto, os sEVs, com uma faixa de tamanho entre 30 e 200 nm, surgiram como uma ferramenta potencial para terapia livre de células na última década. Várias técnicas foram desenvolvidas para isolar sEVs de CTMs. Entretanto, ultracentrifugação diferencial, ultrafiltração, precipitação à base de polímero, captura de imunoafinidade e precipitação baseada em microfluídica possuem diferente.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
A publicação deste vídeo foi apoiada por My CytoHealth Sdn. Bhd.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 40% de acrilamida | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% etanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Desinfetantes |
| Metanol Absoluto | Chemiz | 45081 | Para ativar a membrana PVDF (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Enzima de dissociação celular |
| persulfato de amônio | Chemiz | 14475 | catalisar a polimerização em gel (Eletroforese em gel |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Anticorpo para marcador de sEVs |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Anticorpo para marcador de sEVs |
| Albumina de soro bovino | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF bloqueio de membrana |
| azul de bromofenol | Nacalai Tesque | 05808-61 | marcador de cor eletroforético |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | isolamento sEVs |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | reagente de detecção de quimioluminescência |
| CryoStor Mídia de congelamento | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Criopreservação celular |
| Dulbecco' s Águia modificada' s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Meios de cultura celular |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Marcadores de peso molecular de proteína |
| Papel absorvente extra grosso | ATTO | tampão reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Produtos químicos para western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Produtos químicos para tampão (Western Blot) |
| proteína de ligação de kappa de camundongo conjugada com peroxidase de rábano (m-IgGκ BP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Anticorpo secundário (Western Blot) |
| Human Wharton' s Células-tronco mesenquimais derivadas de geléia (MSCs) | Centro de Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa, Faculdade de Medicina, Universidade Nacional da Malásia | ||
| anticorpos de camundongo anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Anticorpo para marcador sEVs |
| Nanosight NS300 equipado com uma câmera CMOS, uma lente objetiva de 20 &vezes, um módulo de laser azul (488 nm) e software NTA v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldeído | Nacalai Tesque | 02890-45 | Fixação de amostra durante |
| TEM penicilina– estreptomicina | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiótico para |
| meio fluoreto de fenilmetilsulfonil | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inibir proteases nas amostras de sEVs após adição de tampão de lise |
| salina tamponada com fosfato | Gibco | 10010023 | fluoreto |
| de polivinilideno (PVDF) de diluição da amostra com tamanho de poro de 0,45 mm | ATTO | Para reter a proteína durante a transferência de proteínas (Western blot) | |
| coquetel de inibidores de protease | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inibir proteases nas amostras de sEVs após adicionar tampão de lise |
| Kit de Ensaio de Proteína Bicinchoninato | Nacalai Tesque | 06385-00 | de medição de proteína |
| com 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Agente redutor para sódio western blot |
| cloreto | Nacalai Tesque | 15266-64 | Produtos químicos para western blot |
| dodecil sulfato de sódio | Nacalai Tesque | 31606-62 | surfactante iônico durante eletroforese em gel |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN microscópio eletrônico de transmissão | FEI, EUA | ||
| tetrametiletilenodiamina | Nacalai Tesque | 33401-72 | produtos químicos para preparar |
| gel tris-base | 1ª Base | BIO-1400-500g | Produtos químicos para tampão (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals para western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager para detecção de sinal western blot |
Referências
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
- Jayabalan, N., et al.
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Reimpressões e permissões
