Detta protokoll visar hur man isolerar humana navelsträngshärledda mesenkymala stamcellers små extracellulära vesiklar (hUC-MSC-sEVs) med en enkel bänkinställning i laboratorieskala. Storleksfördelningen, proteinkoncentrationen, sEV-markörerna och morfologin hos isolerade hUC-MSC-sEVs kännetecknas av nanopartikelspårningsanalys, BCA-proteinanalys, western blot respektive transmissionselektronmikroskop.
Den ultracentrifugeringsbaserade processen anses vara den vanliga metoden för isolering av små extracellulära vesiklar (sEV). Utbytet från denna isoleringsmetod är dock relativt lägre, och dessa metoder är ineffektiva för att separera sEV-subtyper. Denna studie demonstrerar en enkel bänkfiltreringsmetod för att isolera humana navelsträngshärledda MSC små extracellulära vesiklar (hUC-MSC-sEVs), framgångsrikt separerade genom ultrafiltrering från det konditionerade mediet av hUC-MSC. Storleksfördelningen, proteinkoncentrationen, exosomala markörer (CD9, CD81, TSG101) och morfologin hos de isolerade hUC-MSC-sEVs karakteriserades med nanopartikelspårningsanalys, BCA-proteinanalys, western blot respektive transmissionselektronmikroskop. De isolerade hUC-MSC-sEVs storlek var 30-200 nm, med en partikelkoncentration på 7,75 × 10 10 partiklar/ml och en proteinkoncentration på80 μg/ml. Positiva band för exosomala markörer CD9, CD81 och TSG101 observerades. Denna studie visade att hUC-MSC-sEVs framgångsrikt isolerades från hUC-MSCs konditionerade medium, och karakterisering visade att den isolerade produkten uppfyllde kriterierna som nämns i Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).
Enligt MISEV 2018 är sEV icke-replikerande lipid-dubbelskiktspartiklar utan funktionell kärna närvarande, med en storlek på 30-200 nm1. MSC-härledda sEVs innehåller viktiga signalmolekyler som spelar viktiga roller i vävnadsregenerering, såsom mikroRNA, cytokiner eller proteiner. De har alltmer blivit en “hotspot” för forskning inom regenerativ medicin och cellfri terapi. Många studier har visat att MSC-härledda sEVs är lika effektiva som MSC vid behandling av olika tillstånd, såsom immunmodulering 2,3,4,5, förbättrad osteogenes6, diabetes mellitus 7,8 eller vaskulär regenerering 9,10. I takt med att prövningarna i tidig fas fortskrider har tre huvudfrågor i samband med den kliniska översättningen av MSC-EV lyfts fram: EV: s utbyte, EV: s renhet (fri från cellskräp och andra biologiska föroreningar som protein och cytokiner) och integriteten hos fosfolipid-dubbelskiktsmembranet i EV: erna efter isolering.
Olika metoder har utvecklats för att isolera sEV och utnyttja densiteten, formen, storleken och ytproteinet hos sEVs11. De två vanligaste metoderna vid sEV-isolering är ultracentrifugeringsbaserade och ultrafiltreringsbaserade tekniker.
Ultracentrifugeringsbaserade metoder betraktas som guldstandardmetoder i sEVs isolering. Två typer av ultracentrifugeringstekniker som vanligtvis används är differentiell ultracentrifugering och densitetsgradient ultracentrifugering. Ultracentrifugeringsmetoder resulterar emellertid ofta i lågt utbyte och kräver dyr utrustning för höghastighets ultracentrifug (100 000–200 000 × g)11. Dessutom är enbart ultracentrifugeringstekniker ineffektiva när det gäller att separera EV-subtyper (sEV och stora EV), vilket resulterar i ett orent sedimentskikt11. Slutligen kan ultracentrifugering av densitetsgradienter också vara tidskrävande och kräva ytterligare försiktighetssteg såsom tillsats av sackarosbuffert för att hämma gradientskadorna under accelerations- och retardationssteg12. Därför leder ultracentrifugering vanligtvis till ett relativt lågt utbyte och kan inte diskriminera mellan olika populationer av EV13, vilket begränsar dess tillämpning för storskalig EV-beredning11.
Den andra metoden för EV-isolering är via ultrafiltrering, som är baserad på storleksfiltrering. Ultrafiltrering är relativt tids- och kostnadseffektivt jämfört med ultracentrifugering, eftersom det inte innebär dyr utrustning eller långa bearbetningstider14. Därför verkar ultrafiltrering vara en effektivare isoleringsteknik än båda ovannämnda ultracentrifugeringsmetoder. De isolerade produkterna kan vara mer specifika baserat på porstorlekar och högre utbyte15. Den extra kraft som uppstår under filtreringsprocessen kan dock leda till deformation eller utbrott av EV16.
Det aktuella dokumentet föreslog ett kostnads- och tidseffektivt bänkprotokoll för att isolera MSC-härledda sEVs för nedströmsanalys och terapeutiska ändamål. Metoden som beskrivs i detta dokument kombinerade en enkel filtreringsmetod med bänkcentrifugering för att isolera EV med hög avkastning och god kvalitet från hUC-MSC för nedströmsanalys, inklusive partikelstorleksanalys, biomarköranalys och elektronmikroskopisk avbildning.
EV är en av de viktiga delmängderna av sekretomet i MSC som spelar en avgörande roll under normala och patologiska processer. Men sEV, med ett storleksintervall mellan 30 och 200 nm, har ökat som ett potentiellt verktyg för cellfri terapi under det senaste decenniet. Olika tekniker utvecklades för att isolera sEV från MSC. Differentiell ultracentrifugering, ultrafiltrering, polymerbaserad utfällning, immunoaffinitetsinfångning och mikrofluidikbaserad utfällning har emellertid olika fördelar och nackdelar<sup c…
The authors have nothing to disclose.
Publiceringen av denna video stöddes av My CytoHealth Sdn. Bhd.
40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |