En enkel bänkfiltreringsmetod för att isolera små extracellulära vesiklar från humana mesenkymala stamceller

Summary

Detta protokoll visar hur man isolerar humana navelsträngshärledda mesenkymala stamcellers små extracellulära vesiklar (hUC-MSC-sEVs) med en enkel bänkinställning i laboratorieskala. Storleksfördelningen, proteinkoncentrationen, sEV-markörerna och morfologin hos isolerade hUC-MSC-sEVs kännetecknas av nanopartikelspårningsanalys, BCA-proteinanalys, western blot respektive transmissionselektronmikroskop.

Abstract

Den ultracentrifugeringsbaserade processen anses vara den vanliga metoden för isolering av små extracellulära vesiklar (sEV). Utbytet från denna isoleringsmetod är dock relativt lägre, och dessa metoder är ineffektiva för att separera sEV-subtyper. Denna studie demonstrerar en enkel bänkfiltreringsmetod för att isolera humana navelsträngshärledda MSC små extracellulära vesiklar (hUC-MSC-sEVs), framgångsrikt separerade genom ultrafiltrering från det konditionerade mediet av hUC-MSC. Storleksfördelningen, proteinkoncentrationen, exosomala markörer (CD9, CD81, TSG101) och morfologin hos de isolerade hUC-MSC-sEVs karakteriserades med nanopartikelspårningsanalys, BCA-proteinanalys, western blot respektive transmissionselektronmikroskop. De isolerade hUC-MSC-sEVs storlek var 30-200 nm, med en partikelkoncentration på 7,75 × 10 10 partiklar/ml och en proteinkoncentration på⁸⁰ μg/ml. Positiva band för exosomala markörer CD9, CD81 och TSG101 observerades. Denna studie visade att hUC-MSC-sEVs framgångsrikt isolerades från hUC-MSCs konditionerade medium, och karakterisering visade att den isolerade produkten uppfyllde kriterierna som nämns i Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

Introduction

Enligt MISEV 2018 är sEV icke-replikerande lipid-dubbelskiktspartiklar utan funktionell kärna närvarande, med en storlek på 30-200 nm¹. MSC-härledda sEVs innehåller viktiga signalmolekyler som spelar viktiga roller i vävnadsregenerering, såsom mikroRNA, cytokiner eller proteiner. De har alltmer blivit en “hotspot” för forskning inom regenerativ medicin och cellfri terapi. Många studier har visat att MSC-härledda sEVs är lika effektiva som MSC vid behandling av olika tillstånd, såsom immunmodulering 2,3,4,5, förbättrad osteogenes⁶, diabetes mellitus ^7,8 eller vaskulär regenerering ^9,10. I takt med att prövningarna i tidig fas fortskrider har tre huvudfrågor i samband med den kliniska översättningen av MSC-EV lyfts fram: EV: s utbyte, EV: s renhet (fri från cellskräp och andra biologiska föroreningar som protein och cytokiner) och integriteten hos fosfolipid-dubbelskiktsmembranet i EV: erna efter isolering.

Olika metoder har utvecklats för att isolera sEV och utnyttja densiteten, formen, storleken och ytproteinet hos sEVs¹¹. De två vanligaste metoderna vid sEV-isolering är ultracentrifugeringsbaserade och ultrafiltreringsbaserade tekniker.

Ultracentrifugeringsbaserade metoder betraktas som guldstandardmetoder i sEVs isolering. Två typer av ultracentrifugeringstekniker som vanligtvis används är differentiell ultracentrifugering och densitetsgradient ultracentrifugering. Ultracentrifugeringsmetoder resulterar emellertid ofta i lågt utbyte och kräver dyr utrustning för höghastighets ultracentrifug (100 000–200 000 × g)¹¹. Dessutom är enbart ultracentrifugeringstekniker ineffektiva när det gäller att separera EV-subtyper (sEV och stora EV), vilket resulterar i ett orent sedimentskikt¹¹. Slutligen kan ultracentrifugering av densitetsgradienter också vara tidskrävande och kräva ytterligare försiktighetssteg såsom tillsats av sackarosbuffert för att hämma gradientskadorna under accelerations- och retardationssteg¹². Därför leder ultracentrifugering vanligtvis till ett relativt lågt utbyte och kan inte diskriminera mellan olika populationer av EV¹³, vilket begränsar dess tillämpning för storskalig EV-beredning¹¹.

Den andra metoden för EV-isolering är via ultrafiltrering, som är baserad på storleksfiltrering. Ultrafiltrering är relativt tids- och kostnadseffektivt jämfört med ultracentrifugering, eftersom det inte innebär dyr utrustning eller långa bearbetningstider¹⁴. Därför verkar ultrafiltrering vara en effektivare isoleringsteknik än båda ovannämnda ultracentrifugeringsmetoder. De isolerade produkterna kan vara mer specifika baserat på porstorlekar och högre utbyte¹⁵. Den extra kraft som uppstår under filtreringsprocessen kan dock leda till deformation eller utbrott av EV¹⁶.

Det aktuella dokumentet föreslog ett kostnads- och tidseffektivt bänkprotokoll för att isolera MSC-härledda sEVs för nedströmsanalys och terapeutiska ändamål. Metoden som beskrivs i detta dokument kombinerade en enkel filtreringsmetod med bänkcentrifugering för att isolera EV med hög avkastning och god kvalitet från hUC-MSC för nedströmsanalys, inklusive partikelstorleksanalys, biomarköranalys och elektronmikroskopisk avbildning.

Protocol

Se materialförteckningen för detaljer om alla material, utrustning och programvara som används i detta protokoll. 1. Mänskliga navelsträngsmesenkymala stamceller och odling Odla hUC-MSC vid en sådddensitet på 5 × 103/cm2 i DMEM, kompletterat med 8% humant trombocytlysat och 1% Pen-Strep. Inkubera cellerna vid 37 °C i 5 %CO2. Byt ut cellodlingsmediet var 3: e dag för att säkerställa korrekt celltillväxt.</…

Representative Results

Figur 2 visar att hUC-MSC-sEVs har ett partikelstorleksläge vid 53 nm, medan andra signifikanta toppar av partikelstorlek var 96 och 115 nm. Koncentrationen av hUC-MSC-sEVs uppmätt med NTA var 7,75 × 1010 partiklar/ml. Proteinkoncentrationen av hUC-MSC-sEVs uppmätt med BCA-analysen var cirka 80 μg/ml. I western blotting-analys visade hUC-MSC-sEVs positiva band för exosomala markörer CD9, CD81 och TSG101, men var negativa för GRP94 (<strong class…

Discussion

EV är en av de viktiga delmängderna av sekretomet i MSC som spelar en avgörande roll under normala och patologiska processer. Men sEV, med ett storleksintervall mellan 30 och 200 nm, har ökat som ett potentiellt verktyg för cellfri terapi under det senaste decenniet. Olika tekniker utvecklades för att isolera sEV från MSC. Differentiell ultracentrifugering, ultrafiltrering, polymerbaserad utfällning, immunoaffinitetsinfångning och mikrofluidikbaserad utfällning har emellertid olika fördelar och nackdelar<sup c…

Materials

40% acrylamide	Nacalai Tesque	06121-95	Western blot
95% ethanol	Nacalai Tesque	14710-25	Disinfectants
Absolute Methanol	Chemiz	45081	To activate PVDF membrane (Western blot)
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Cell dissociation enzyme
ammonium persulfate	Chemiz	14475	catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis
anti-CD 81 (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	Antibody for sEVs marker
anti-TSG 101 (C-2)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7964	Antibody for sEVs marker
Bovine serum albumin	Nacalai Tesque	00653-31	PVDF membrane blocking
bromophenol blue	Nacalai Tesque	05808-61	electrophoretic color marker
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)	Millipore	UFC710008	sEVs isolation
ChemiLumi One L	Nacalai Tesque	7880	chemiluminescence detection reagent
CryoStor Freezing Media	Sigma-Aldrich	C3124-100ML	Cell cryopreserve
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Nacalai Tesque	08458-45	Cell culture media
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker	SMOBIO	PM2610	Protein molecular weight markers
Extra thick blotting paper	ATTO		buffer reservior (Western blot)
Glycerol	Merck	G5516	Chemicals for western blot
Glycine	1st Base	BIO-2085-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP)	Santa Cruz Biotechnology	sc-516102	Secondary antibody (Western Blot)
Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118	Antibody for sEVs marker
Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2	Malvern Panalytical, UK
paraformaldehyde	Nacalai Tesque	02890-45	Sample Fixation during TEM
penicillin–streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Antibiotic for media
phenylmethylsulfonyl fluoride	Nacalai Tesque	27327-81	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Washing, sample dilution
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size	ATTO		To hold protein during protein transfer (Western blot)
protease inhibitor cocktail	Nacalai Tesque	25955-11	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
Protein Assay Bicinchoninate Kit	Nacalai Tesque	06385-00	Protein measurement
sample buffer solution with 2-ME	Nacalai Tesque	30566-22	Reducing agent for western blot
sodium chloride	Nacalai Tesque	15266-64	Chemicals for western blot
sodium dodecyl sulfate	Nacalai Tesque	31606-62	ionic surfactant during gel electrophoresis
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope	FEI, USA
tetramethylethylenediamine	Nacalai Tesque	33401-72	chemicals to prepare gel
tris-base	1st Base	BIO-1400-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
Tween 20	GeneTex	GTX30962	Chemicals for western blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD imager			CCD imager for western blot signal detection