यह प्रोटोकॉल भ्रूण आंतों के ऊतकों से एक त्रि-आयामी आंतों के मॉडल, एंटरोइड्स की स्थापना का विवरण देता है। मॉडल लक्षण वर्णन के लिए उपकला बायोमार्कर के इम्यूनोफ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग किया गया था। फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान के रिसाव द्वारा मापी गई खुराक-निर्भर तरीके से माइक्रोइंजेक्शन तकनीक का उपयोग करके लिपोपॉलेसेकेराइड, एक जीवाणु एंडोटॉक्सिन का एपिकल एक्सपोजर एपिथेलियल पारगम्यता को प्रेरित करता है।
मानव भ्रूण ऊतक-व्युत्पन्न एंटरोइड्स प्रीटरम शिशुओं में आंतों की चोटों का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक इन विट्रो मॉडल के रूप में उभर रहे हैं। एंटरोइड्स ध्रुवीयता का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें एक एपिकल सीमा, तंग जंक्शन और विकास मीडिया के संपर्क में आने वाली एक बेसोलेटरल बाहरी परत के साथ एक लुमेन शामिल होता है। आंतों की चोटों के परिणामों में म्यूकोसल सूजन और बढ़ी हुई पारगम्यता शामिल है। कमजोर अपरिपक्व मानव विषयों में आंतों की पारगम्यता का परीक्षण अक्सर संभव नहीं होता है। इस प्रकार, प्रीटरम शिशुओं में आंतों की चोटों का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो भ्रूण ऊतक-व्युत्पन्न आंतों के मॉडल की आवश्यकता होती है। एंटरोइड्स का उपयोग तंग जंक्शन प्रोटीन द्वारा विनियमित उपकला पारगम्यता में परिवर्तन का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। एंटरोइड्स में, आंतों की स्टेम कोशिकाएं सभी उपकला कोशिका प्रकारों में अंतर करती हैं और माउस सारकोमा कोशिकाओं द्वारा स्रावित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर एक त्रि-आयामी संरचना बनाती हैं। इस लेख में, हम भ्रूण आंतों के ऊतकों से एंटरोइड ्स स्थापित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों का वर्णन करते हैं, इम्यूनोफ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ एंटरॉइड तंग जंक्शन प्रोटीन की विशेषता और उपकला पारगम्यता का परीक्षण करते हैं। चूंकि ग्राम-नकारात्मक प्रमुख बैक्टीरियल डिस्बिओसिस आंतों की चोट के लिए एक ज्ञात जोखिम कारक है, इसलिए हमने एंटरोइड्स में पारगम्यता को प्रेरित करने के लिए ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित एक एंडोटॉक्सिन लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) का उपयोग किया। फ्लोरेसिन-लेबल डेक्सट्रान को एंटरोइड लुमेन में माइक्रोइंजेक्शन किया गया था, और पैरासेल्युलर पारगम्यता में परिवर्तन को मापने के लिए संस्कृति मीडिया में लीक हुए सीरियल डेक्सट्रान सांद्रता को मापा गया था। प्रयोग से पता चला कि एलपीएस के लिए एपिकल एक्सपोजर एक एकाग्रता-निर्भर तरीके से उपकला पारगम्यता को प्रेरित करता है। ये निष्कर्ष इस परिकल्पना का समर्थन करते हैं कि ग्राम-नकारात्मक प्रमुख डिस्बिओसिस अपरिपक्व शिशुओं में आंतों की चोट के तंत्र में योगदान देता है।
अपरिपक्व शिशुओं को लगातार और लंबे समय तक सूजन के संपर्क में लाया जाता है जो उन्हें आंतों की चोट के लिए बढ़ते जोखिम में डालता है जिसके परिणामस्वरूप दीर्घकालिक विकलांगता या मृत्युहो जाती है। इस क्षेत्र में अनुसंधान को कमजोर अपरिपक्व शिशुओं पर प्रयोगों का संचालन करने की सीमित क्षमता से चुनौती दी जाती है। इसके अलावा, उपयुक्त मॉडल की कमी ने समय से पहले आंतों के वातावरण के व्यापक अध्ययन मेंबाधा डाली है। मौजूदा इन विट्रो और विवो मॉडल समय से पहले मानव आंतों के वातावरण का व्यापक रूप से प्रतिनिधित्व करने में विफल रहे हैं। विशेष रूप से, एकल उपकला भ्रूण कोशिका लाइनें तंग जंक्शनों का निर्माण नहीं कर सकती हैं, और पशु मॉडल मानव अपरिपक्व शिशुओं की तुलना में विभिन्न भड़काऊ और प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करते हैं। आंतों के क्रिप्ट स्टेम कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव में एक प्राथमिक मार्ग के रूप में डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग की खोज और नोवेल एलजीआर 5 + ऊतक स्टेम कोशिकाओं के साथ, आंतों के ऊतक-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स जैसे एंटरोइड्स और कोलोनोइड्स को इन विट्रो मॉडल 3,4,5 के रूप में स्थापित किया गया था। इस तकनीक का उपयोग करके, तीन आयामी (3 डी) एंटरॉइड मॉडल बनाना और उपयोग करना संभव है जो आंतों के वातावरण 6,7 के उपकला प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए पूरे ऊतक या आंत की बायोप्सी से विकसितहोते हैं।
संस्कृति में उगाई जाने वाली विशिष्ट आंतों की कोशिका लाइनों के विपरीत, एंटरोइड्स तंग जंक्शन प्रोटीन 8 से जुड़े लुमेन के साथ ध्रुवीयता प्रदर्शित करतेहैं। यह विकास मीडिया में बेसोलेटरल सीमा के संपर्क में आने की अनुमति देता है, साथ ही एपिकल सीमा का आकलन करने के लिए ल्यूमिनल माइक्रोइंजेक्शन भी करता है। इसके अलावा, एंटरोइड्स मानव उपकला 9,10 के समान आनुवंशिक, शारीरिक और प्रतिरक्षाविज्ञानी विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं। भ्रूण ऊतक-व्युत्पन्न एंटरोइड उपकला समारोह पर समयपूर्वता की भूमिका की परीक्षा के लिए अनुमति देते हैं। एंटरोइड्स की अनूठी विशेषताएं प्रीटरम आंतों के वातावरण से अधिक निकटता से मिलती-जुलती हो सकतीहैं। ऊतक-व्युत्पन्न एंटरोइड्स का उपयोग एक मोनोलेयर रूप के रूप में तंग जंक्शन अखंडता के लिए परीक्षण करने के लिए या एक ठोस तहखाने झिल्ली प्रोटीन मिश्रण में एम्बेडेड 3 डी संरचनाओं के रूप में किया जा सकता है। यदि एपिकल एक्सपोजर वांछित है तो बाद के रूप के लिए एक माइक्रोइंजेक्शन तकनीक की आवश्यकता होती है। एंटरॉइड मॉडल में उपकला प्रतिक्रियाओं के माप में आरएनए अनुक्रमण द्वारा जीन अभिव्यक्ति, एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसे (एलिसा) द्वारा बायोमार्कर, या उन्नत इमेजिंग तकनीक शामिल हैं। यहां प्रस्तुत तकनीक फ्लोरोमेट्री के साथ सकल पारगम्यता को मापने के लिए एक और व्यवहार्य विकल्प प्रदान करती है।
अपरिपक्व शिशुओं में आंतों की चोट में एक बहुक्रियात्मक रोगजनन होता है जिसमें आंत माइक्रोबियल समुदाय का असंतुलन शामिल होता है। एंटरोइड्स प्रीटरम आंतों के रोगों के कुछ पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट मॉडल प्रदान कर सकते हैं जैसे कि नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस जिसमें उपकला कार्य शामिल हैं। एंटरोइड्स मानव भ्रूण आंत10 के समान विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं। बेसोलेटरल एक्सपोजर के रूप में संस्कृति मीडिया में ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित एक एंडोटॉक्सिन लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) के लिए एंटरोइड्स को उजागर करना जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है जिससे सूजन और आंतोंकी पारगम्यता बढ़ सकती है। इस अध्ययन का उद्देश्य एलपीएस जैसे जीवाणु उत्पादों के एपिकल एक्सपोजर के बाद सकल उपकला पारगम्यता में परिवर्तन का मूल्यांकन करना है। परिणाम आंतों की चोट के रोगजनन में शामिल माइक्रोब-एपिथेलियल इंटरैक्शन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। सकल पारगम्यता का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन की गई विधि के लिए माइक्रोइंजेक्शन सेटअप और कौशल की आवश्यकता होती है।
यह प्रोटोकॉल भ्रूण आंतों के ऊतकों से एंटरोइड्स की स्थापना का विवरण देता है, साथ ही इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन और उपकला पारगम्यता परीक्षण के साथ मॉडल लक्षण वर्णन भी करता है। एंटरोइड्स की पारगम्यता का परीक्षण एक माइक्रोइंजेक्शन तकनीक और संस्कृति मीडिया में लीक डेक्सट्रान-एफआईटीसी एकाग्रता के सीरियल टाइम कोर्स माप का उपयोग करके किया गया था। इस प्रोटोकॉल की नवीनता एपिकल एक्सपोजर है जो संस्कृति मीडिया 7 में बेसोलेटरल एक्सपोजर की तुलना में मानव आंतों के शरीर विज्ञान से अधिक निकटता सेमिलता जुलता है। पिछले अध्ययनों में, हिल एट अल ने सीरियल इमेजिंग और समय16 के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना का उपयोग किया। एरेस एट अल ने एक उपकला मॉडल के बेसोलेटरल झिल्ली को एलपीएस में उजागर किया और फिर सेलुलर जीन अभिव्यक्ति पैटर्न7 की तुलना की। इसकी तुलना में, हम परीक्षण किए गए अभिकर्मकों के एपिकल एक्सपोजर का उपयोग करते हैं और फिर संस्कृति मीडिया में लीक डेक्सट्रान की सीरियल सांद्रता को मापकर सकल पारगम्यता में संभावित परिवर्तनों की जांच करते हैं। हमारी विधि सेलुलर एमआरएनए एकत्र करके संस्कृति मीडिया और जीन अभिव्यक्ति में उपकला कोशिकाओं द्वारा उत्पादित साइटोकिन्स के सीरियल तुलनात्मक विश्लेषण की भी अनुमति देती है। एलपीएस का उपयोग आमतौर पर पशु और इन विट्रो मॉडल में आंतों की चोट का अध्ययन करने के लिए किया जाता है क्योंकि इसकी पारगम्यता और सूजन को प्रेरित करने की क्षमता 7,17 है। जब इस मॉडल में एलपीएस का परीक्षण किया गया था, तो उपकला पारगम्यता को एक्सपोजर एकाग्रता द्वारा विभेदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल को विभिन्न सूक्ष्म इंजेक्शन सामग्री और परिणाम माप का उपयोग करके अन्य रोग विकृति का अध्ययन करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में भ्रूण की आंतों के ऊतकों से एंटरोइड्स स्थापित करना, एंटरॉइड लक्षण वर्णन और माइक्रोइंजेक्शन तकनीक शामिल हैं। इस अध्ययन की अखंडता सटीक सेल नमूनाकरण पर निर्भर करती है। शारीरिक स्थलों और रक्त वाहिकाओं का उपयोग करना छोटी आंतों की कोशिकाओं के चयन को सुनिश्चित करने के लिए सहायक है। भ्रूण आंतों की स्टेम कोशिकाओं के मजबूत विकास और भेदभाव के कारण, स्टेम कोशिकाओं को अन्य उपकला कोशिकाओं से अलग करने के लिए एक व्यापक प्रक्रिया आवश्यक नहीं है। एंटरोइड्स स्थापित होने के बाद, प्रोटीन और सेल मार्करों के लिए धुंधला करके मॉडल की विशेषताओं की पुष्टि करना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, एंटरोइड्स को विलिन और सीडीएक्स 2 का उपयोग करके एंटरोसाइट्स के लिए दाग दिया गया था, लाइसोजाइम का उपयोग करके पनेथ कोशिकाओं, और म्यूसिन का उपयोग करके गोब्लेट कोशिकाओं, सभी कोशिकाएं जो छोटी आंत उपकला 18,19,20 के भीतर पाई जाती हैं। पारंपरिक एकल सेल लाइनों के विपरीत जो एक सेल प्रकार प्रदर्शित करते हैं, एंटरोइड आंतों के पूर्वज स्टेम कोशिकाओं से सभी सेल प्रकार स्थापित करतेहैं। इस प्रोटोकॉल के धुंधला हिस्से को रुचि के विशिष्ट सेलुलर मार्करों के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल की विश्वसनीयता के लिए महत्वपूर्ण माइक्रोइंजेक्शन तकनीक है। माइक्रोपिपेट युक्तियों की स्थिरता को डेक्सट्रान-एफआईटीसी समाधान का उपयोग करके प्रति पंप मात्रा को मापकर और माइक्रोस्कोप के तहत युक्तियों के व्यास की कल्पना करके सत्यापित किया जा सकता है। संदूषण के जोखिम के कारण, एक ही माइक्रोपिपेट का उपयोग एक से अधिक जोखिम के लिए नहीं किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एंटरोइड्स का आकार और विकास उनके विकास मीडिया की सामग्री से प्रभावित हो सकता है। हमने पाया कि फूलगोभी के आकार के एंटरोइड्स के बजाय गोलाकार ने माइक्रोइंजेक्शन के लिए बेहतर मॉडल प्रदान किए। गोलाकार आकार मीडिया21 में एक अधिक डब्ल्यूएनटी कारक द्वारा प्रेरित किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल काफी हद तक विविधताओं को कम करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन में कलाकार के कौशल पर निर्भर करता है, खासकर समय-संवेदनशील माप में। सुसंगत तकनीकों के साथ एक ही अनुभवी कलाकार होने से भिन्नताओं को कम किया जा सकता है, आनुवंशिक भिन्नता से बचने के लिए एक ही सेल मूल का उपयोग करके, परिपक्वता पूर्वाग्रह को दूर करने के लिए एक ही मार्ग पर परीक्षण करके, और समान सेल भेदभाव के लिए एक ही प्रकार के मीडिया में कोशिकाओं को बढ़ाकर। विकास मीडिया के घटक विवो वातावरण के बजाय विट्रो में स्टेम कोशिकाओं के अलग-अलग भेदभाव को प्रेरित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, विवो में, लाइसोजाइम गर्भकालीन विकास के 22-24 सप्ताह तक व्यक्त नहीं किया जाता है जब पनेथ कोशिकाएं बनती हैंऔर कार्यात्मक हो जाती हैं। हालांकि, हम 10 सप्ताह के भ्रूण आंतों से स्थापित हमारे एंटरोइड्स में लाइसोजाइम का पता लगाने में सक्षम थे। यह विधि माइक्रोइंजेक्शन के लिए आवश्यक उच्च तकनीकी कौशल के कारण एक समय में परीक्षण किए गए एक्सपोज़र की संख्या को सीमित कर सकती है। माइक्रोइंजेक्शन पंचर छेद से डेक्सट्रान रिसाव पारगम्यता के आकलन को प्रभावित कर सकता है। इस प्रभाव को खत्म करने के लिए, माइक्रोइंजेक्शन के तुरंत बाद ट्रिपल वॉश को प्रक्रिया से अवशिष्ट डेक्सट्रान को हटाने की सिफारिश की जाती है। मीडिया में डेक्सट्रान एकाग्रता को माइक्रोइंजेक्शन के बाद 4-6 घंटे के लिए प्रति घंटा मापा जाना चाहिए। इंजेक्शन के बाद 2-4 घंटे के भीतर डेक्सट्रान एकाग्रता में महत्वपूर्ण वृद्धि वाले प्रयोगों को अंतिम विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए।
इस विधि के कई फायदे हैं। ट्रांसवेल पर एंटरॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर की तुलना में इसे कम लागत और कम संसाधनों की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, आंत रोगाणुओं और उपकला के बीच प्रारंभिक बातचीत का अध्ययन करने के लिए जीवित बैक्टीरिया या वायरस जैसे अन्य एक्सपोजर में इसका विस्तार किया जा सकता है। एंटरॉइड के संलग्न लुमेन विकास मीडिया 13 के संदूषण के बिना माइक्रोइंजेक्टेड लाइव बैक्टीरिया की स्थिर वृद्धि को बनाए रखसकते हैं। मोनोलेयर के विकास मीडिया और इनक्यूबेशन ऑक्सीजन के संपर्क में आने के विपरीत, संलग्न लुमेन एक तंग, पृथक स्थान है। एक संलग्न लुमेन विकास मीडिया और एक ल्यूमिनल ऑक्सीजन सामग्री के लिए कोई संचार नहीं करने की अनुमति देता है जो जीवितजीवाणु विकास के साथ समय के साथ कम होता है।
भ्रूण आंतों के ऊतकों का उपयोग वयस्क आंतों के स्टेम कोशिकाओं या पशु मॉडल 7 की तुलना में अपरिपक्व शिशुओं के आंतों के उपकला को अधिक सटीक रूप सेदर्शाता है। इसके अलावा, एंटरोइड्स की ध्रुवीयता एपिकल और बेसोलेटरल एक्सपोजर और माप23 दोनों के लिए अनुमति देती है। एंटरोइड्स कम ऑक्सीकरण एकाग्रता के साथ एक संलग्न लुमेन बनाते हैं, जो आंतों की ऑक्सीकरण एकाग्रता की अधिक बारीकी सेनकल करता है। अधिक तकनीकी रूप से उन्नत प्रोटोकॉल16 के विपरीत, सकल मीडिया माप का उपयोग इस तकनीक की अधिक पहुंच की अनुमति देता है। प्रयोग से पता चला कि उपकला रिसाव एलपीएस के एपिकल एक्सपोजर से प्रेरित हो सकता है और एकाग्रता-निर्भर है। चूंकि यह विधि डेक्सट्रान की लीक एकाग्रता में परिवर्तन की जांच करती है, इसलिए यह तंग जंक्शनों में सकल कार्यात्मक परिवर्तनों का पता लगाने के लिए उपयोगी है। मैसेंजर आरएनए संग्रह और उजागर एंटरोइड्स का अनुक्रमण और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण सकल कार्यात्मक परिवर्तनों के विश्लेषण का पूरक हो सकता है। यह मॉडल एक प्रणाली में आंतों के उपकला अखंडता का अध्ययन करता है जो अत्यधिक अपरिपक्व वातावरण जैसा दिखता है और इस प्रकार, अपरिपक्व आंतों की चोटों और अन्य रोग विकृति की बेहतर समझ हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम भ्रूण के ऊतकों को साझा करने के लिए वाशिंगटन विश्वविद्यालय में जन्म दोष अनुसंधान प्रयोगशाला में डॉ इयान ग्लास और कर्मियों को धन्यवाद देते हैं। हम मिशिगन विश्वविद्यालय में ट्रांसलेशनल ऊतक मॉडलिंग प्रयोगशाला में डॉ माइकल डेम और डॉ जेसन स्पेंस को भी पूरी प्रक्रिया में उनके अंतहीन समर्थन और मार्गदर्शन के लिए धन्यवाद देते हैं।
Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1×0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
Petri Dishes, 35×10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
Petri Dishes, 60×15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
Primocin 50 mg/mL, 10×1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
Wall air supply | N/A | N/A | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |