Denne protokollen beskriver etableringen av enteroider, en tredimensjonal tarmmodell, fra fosterets tarmvev. Immunfluorescerende avbildning av epitelbiomarkører ble brukt til modellkarakterisering. Apikal eksponering av lipopolysakkarider, et bakterielt endotoksin, ved bruk av mikroinjeksjonsteknikk induserte epitelpermeabilitet på en doseavhengig måte målt ved lekkasje av fluorescerende dextran.
Humane fostervevsavledede enteroider fremstår som en lovende in vitro-modell for å studere tarmskader hos premature spedbarn. Enteroider utviser polaritet, bestående av et lumen med en apikal kant, tette kryss og et basolateralt ytre lag utsatt for vekstmedier. Konsekvensene av tarmskader inkluderer slimhinnebetennelse og økt permeabilitet. Testing av intestinal permeabilitet hos sårbare premature mennesker er ofte ikke mulig. Dermed er det nødvendig med en in vitro fostervevsavledet tarmmodell for å studere tarmskader hos premature spedbarn. Enteroider kan brukes til å teste endringer i epitelpermeabilitet regulert av tette kryssproteiner. I enteroider skiller tarmstamceller seg til alle epitelcelletyper og danner en tredimensjonal struktur på en kjellermembranmatrise utskilt av musesarkomceller. I denne artikkelen beskriver vi metodene som brukes for å etablere enteroider fra føtalt tarmvev, karakterisere de enteroide tette kryssproteinene med immunfluorescerende avbildning og teste epitelpermeabilitet. Siden gramnegativ dominant bakteriell dysbiose er en kjent risikofaktor for tarmskade, brukte vi lipopolysakkarid (LPS), et endotoksin produsert av gramnegative bakterier, for å indusere permeabilitet i enteroidene. Fluorescein-merket dextran ble mikroinjisert i enteroid lumen, og serielle dekstrankonsentrasjoner lekket inn i kulturmediet ble målt for å kvantifisere endringene i paracellulær permeabilitet. Forsøket viste at apikal eksponering for LPS induserer epitelpermeabilitet på en konsentrasjonsavhengig måte. Disse funnene støtter hypotesen om at gramnegativ dominant dysbiose bidrar til mekanismen for tarmskade hos premature spedbarn.
Premature spedbarn blir utsatt for hyppig og langvarig betennelse som setter dem i økt risiko for tarmskade som resulterer i langvarig funksjonshemming eller død1. Forskningen på dette området utfordres av den begrensede evnen til å gjennomføre forsøk på sårbare premature barn. Videre har mangel på egnede modeller hindret den omfattende studien av det for tidlige tarmmiljøet2. Eksisterende in vitro og in vivo modeller har ikke klart å representere det for tidlige humane tarmmiljøet. Spesielt kan enkeltepitelcellelinjer ikke danne tette kryss, og dyremodeller utviser forskjellige inflammatoriske og immunologiske responser enn menneskelige premature spedbarn. Med oppdagelsen av Wnt-signalering som en primær vei i spredning og differensiering av tarmkryptstamceller og de nye Lgr5+ vevsstamceller, ble tarmvevsavledede organoider som enteroider og kolonoider etablert som in vitro-modeller 3,4,5. Ved hjelp av denne teknologien er det mulig å lage og utnytte tredimensjonale (3D) enteroidmodeller som er utviklet fra hele vev eller biopsi i tarmen for å studere epitelresponser på tarmmiljøet 6,7.
I motsetning til typiske tarmcellelinjer dyrket i kultur, utviser enteroider polaritet med et lumen forbundet med tette kryssproteiner8. Dette muliggjør eksponering for den basolaterale grensen i vekstmediet, samt luminal mikroinjeksjon for å vurdere den apikale grensen. Videre viser enteroider lignende genetiske, fysiologiske og immunologiske egenskaper som det menneskelige epitelet 9,10. Fostervevsavledede enteroider tillater undersøkelse av prematuritetens rolle på epitelfunksjonen. De unike egenskapene til enteroider kan ligne det premature tarmmiljøet nærmere9. Vevsavledede enteroider kan brukes til å teste for tett kryssintegritet som en monolagsform eller som 3D-strukturer innebygd i en størknet kjellermembranproteinblanding. En mikroinjeksjonsteknikk er nødvendig for sistnevnte form hvis en apikal eksponering er ønsket. Måling av epitelresponser i enteroidmodeller inkluderer genuttrykk ved RNA-sekvensering, biomarkører ved enzymbundet immunoassay (ELISA) eller avanserte bildebehandlingsteknikker. Teknikken som presenteres her gir et annet mulig alternativ for å måle brutto permeabilitet med fluorometri.
Tarmskade hos premature spedbarn har en multifaktoriell patogenese som inkluderer ubalansen i tarmmikrobielle samfunn. Enteroider kan gi gode modeller for å studere visse aspekter av premature tarmsykdommer som nekrotiserende enterokolitt som involverer epitelfunksjoner11. Enteroider viser lignende egenskaper som den menneskelige føtale tarmen10. Eksponering av enteroider for lipopolysakkarid (LPS), et endotoksin produsert av gramnegative bakterier, i kulturmediet som en basolateral eksponering induserer genuttrykk som kan føre til økt betennelse og tarmpermeabilitet7. Denne studien tar sikte på å evaluere endringene i brutto epitelpermeabilitet etter apikal eksponering for bakterielle produkter som LPS. Resultatene kan gi innsikt i mikrobe-epitelinteraksjonene som er involvert i patogenesen av tarmskade. Metoden designet for å teste brutto permeabilitet krever mikroinjeksjonsoppsett og dyktighet.
Denne protokollen beskriver etablering av enteroider fra fosterets tarmvev, samt modellkarakterisering med immunfluorescerende farging og epitelpermeabilitetstesting. Permeabiliteten til enteroidene ble testet ved hjelp av en mikroinjeksjonsteknikk og serielle tidsforløpsmålinger av lekket dextran-FITC-konsentrasjon i kulturmediene. Nyheten i denne protokollen er den apikale eksponeringen som ligner mer på menneskelig tarmfysiologi sammenlignet med basolateral eksponering i kulturmediene7. I tidligere studier benyttet Hill og medarbeidere seriell avbildning og beregning av fluorescensintensiteten over tid16. Ares og medarbeidere eksponerte den basolaterale membranen til en epitelmodell for LPS og sammenlignet deretter det cellulære genuttrykksmønsteret7. Til sammenligning bruker vi apikal eksponering av de testede reagensene og undersøker deretter potensielle endringer i brutto permeabilitet ved å måle serielle konsentrasjoner av lekket dextran i kulturmediene. Vår metode tillater også seriell komparativ analyse av cytokiner produsert av epitelceller i kulturmedier og genuttrykk ved å samle cellulært mRNA. LPS har blitt ofte brukt til å studere tarmskade i dyre- og in vitro-modeller på grunn av sin evne til å indusere permeabilitet og betennelse 7,17. Når LPS ble testet i denne modellen, ble epitelpermeabilitet differensiert ved eksponeringskonsentrasjon. Denne protokollen kan utvides til å studere andre sykdomspatologier ved hjelp av forskjellige mikroinjiserte materialer og utfallsmålinger.
Kritiske trinn i denne protokollen inkluderer etablering av enteroider fra føtalt tarmvev, enteroid karakterisering og mikroinjeksjonsteknikk. Integriteten til denne studien avhenger av nøyaktig celleprøvetaking. Bruk av anatomiske landemerker og blodårer er nyttig for å sikre valg av små tarmceller. På grunn av den robuste veksten og differensieringen av føtale intestinale stamceller, er det ikke nødvendig med en omfattende prosedyre for å isolere stamcellene fra andre epitelceller. Etter at enteroidene er etablert, er det viktig å bekrefte egenskapene til modellen ved å fargelegge proteiner og cellemarkører. I denne protokollen ble enteroidene farget for enterocytter ved bruk av villin og CDX2, Paneth-celler som bruker lysozym og begerceller ved bruk av mucin, alle cellene som finnes i tynntarmepitelet18,19,20. I motsetning til tradisjonelle enkeltcellelinjer som viser en celletype, etablerer enteroider alle celletyper fra tarmprogenitorstamceller8. Fargedelen av denne protokollen kan endres for de spesifikke cellulære markørene av interesse. Avgjørende for påliteligheten til denne protokollen er mikroinjeksjonsteknikken. Konsistensen til mikropipettespissene kan verifiseres ved å måle volumet per pumpe ved hjelp av dextran-FITC-løsning og visualisere diameteren på spissene under mikroskopet. På grunn av risikoen for kontaminering kan ikke den samme mikropipetten brukes til mer enn én eksponering. I tillegg kan formen og veksten av enteroider påvirkes av innholdet i deres vekstmedier. Vi fant at de sfæriske snarere enn blomkålformede enteroider ga bedre modeller for mikroinjeksjon. Den sfæriske formen kan induseres av en større Wnt-faktor i media21.
Denne protokollen avhenger i stor grad av utøverens ferdigheter i mikroinjeksjon for å redusere variasjoner, spesielt i tidsfølsomme målinger. Variasjoner kan minimeres ved å ha den samme erfarne utøveren med konsistente teknikker, bruke samme celleopprinnelse for å unngå genetisk variasjon, teste ved samme passasje for å fjerne modenhetsskjevhet og dyrke cellene i samme type media for lignende celledifferensiering. Komponentene i vekstmediet kan indusere varierende differensiering av stamceller in vitro i stedet for i et in vivo miljø. For eksempel, in vivo, uttrykkes ikke lysozym før uke 22-24 av svangerskapsutviklingen når Paneth-celler dannes og blir funksjonelle22. Imidlertid var vi i stand til å oppdage lysozym i våre enteroider etablert fra 10-ukers føtale tarmer. Denne metoden kan begrense antall testede eksponeringer på en gang på grunn av den høye tekniske ferdigheten som kreves for mikroinjeksjon. Dekstranlekkasjen fra mikroinjeksjonshullet kan påvirke vurderingen av permeabilitet. For å eliminere denne effekten anbefales trippelvask umiddelbart etter mikroinjeksjonen for å fjerne gjenværende dekstran fra prosedyren. Dekstrankonsentrasjonen i media bør måles hver time i 4-6 timer etter mikroinjeksjon. Eksperimenter med signifikant økning i dekstrankonsentrasjonen innen 2-4 timer etter injeksjon bør utelukkes fra den endelige analysen.
Denne metoden har flere fordeler. Det krever lavere kostnader og færre ressurser sammenlignet med enteroid-avledede monolag på transwell. I tillegg kan den utvides til andre eksponeringer som levende bakterier eller virus for å studere den første interaksjonen mellom tarmmikrober og epitelet. Det vedlagte lumen i enteroiden kan opprettholde en stabil vekst av mikroinjiserte levende bakterier uten forurensning av vekstmediet13. I motsetning til monolaget som blir utsatt for vekstmedier og inkubasjonsoksygen, er det vedlagte lumen et tett, isolert rom. Et lukket lumen gir ingen kommunikasjon til vekstmediet og et luminalt oksygeninnhold som er lavere over tid med levende bakterievekst13.
Bruken av føtalt tarmvev viser mer nøyaktig tarmepitelet hos premature spedbarn sammenlignet med voksne intestinale stamceller eller dyremodeller7. Videre tillater polariteten til enteroider både apikale og basolaterale eksponeringer og målinger23. Enteroidene danner et lukket lumen med lavere oksygeneringskonsentrasjon, som nærmere etterligner oksygeneringskonsentrasjonen i tarmene24. I motsetning til mer teknologisk avanserte protokoller16, gir bruk av brutto mediemålinger større tilgjengelighet av denne teknikken. Forsøket viste at epitellekkasje kan induseres ved apikal eksponering for LPS og er konsentrasjonsavhengig. Siden denne metoden undersøker endringene i lekket konsentrasjon av dextran, er den nyttig for å oppdage bruttofunksjonelle endringer i tette kryss. Messenger RNA-innsamling og sekvensering av de eksponerte enteroider og western blot-analyse kan utfylle analyse av bruttofunksjonelle endringer. Denne modellen studerer tarmepitelintegritet i et system som ligner sterkt på det premature miljøet og dermed kan brukes til å få en bedre forståelse av premature tarmskader og andre sykdomspatologier.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Ian Glass og personalet ved Birth Defects Research Laboratory ved University of Washington for å dele fostervevet. Vi takker også Dr. Michael Dame og Dr. Jason Spence ved Translational Tissue Modeling Laboratory ved University of Michigan for deres endeløse støtte og veiledning gjennom hele prosessen.
Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1×0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
Petri Dishes, 35×10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
Petri Dishes, 60×15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
Primocin 50 mg/mL, 10×1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
Wall air supply | N/A | N/A | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |