Microtensiomètre pour la visualisation en microscopie confocale d’interfaces dynamiques

Summary

Ce manuscrit décrit la conception et le fonctionnement d’un microtensiomètre/microscope confocal pour effectuer des mesures simultanées de la tension interfaciale et de la rhéologie dilatationnelle de surface tout en visualisant la morphologie interfaciale. Cela fournit la construction en temps réel des relations structure-propriété des interfaces importantes en technologie et en physiologie.

Abstract

L’adsorption de molécules tensio-actives aux interfaces fluide-fluide est omniprésente dans la nature. Pour caractériser ces interfaces, il faut mesurer les taux d’adsorption des tensioactifs, évaluer les tensions superficielles d’équilibre en fonction de la concentration en vrac de tensioactifs et relier la façon dont la tension superficielle change avec les changements dans la zone interfaciale après l’équilibre. La visualisation simultanée de l’interface à l’aide de l’imagerie par fluorescence avec un microscope confocal à grande vitesse permet l’évaluation directe des relations structure-fonction. Dans le microtensiomètre à pression capillaire (CPM), une bulle d’air hémisphérique est épinglée à l’extrémité du capillaire dans un réservoir de liquide de volume de 1 mL. La pression capillaire à travers l’interface de bulle est contrôlée via un régulateur de débit microfluidique commercial qui permet un contrôle de la pression, de la courbure de bulle ou de la zone de bulle basé sur un modèle basé sur l’équation de Laplace. Par rapport aux techniques précédentes telles que l’auge de Langmuir et la goutte pendentive, la précision de mesure et de contrôle et le temps de réponse sont considérablement améliorés; les variations de pression capillaire peuvent être appliquées et contrôlées en quelques millisecondes. La réponse dynamique de l’interface à bulles est visualisée via une deuxième lentille optique à mesure que la bulle se dilate et se contracte. Le contour de la bulle est ajusté à un profil circulaire pour déterminer le rayon de courbure de la bulle, R, ainsi que tout écart par rapport à la circularité qui invaliderait les résultats. L’équation de Laplace est utilisée pour déterminer la tension superficielle dynamique de l’interface. Après l’équilibrage, de petites oscillations de pression peuvent être imposées par la pompe microfluidique contrôlée par ordinateur pour faire osciller le rayon de la bulle (fréquences de 0,001-100 cycles/min) pour déterminer le module dilatationnel Les dimensions globales du système sont suffisamment petites pour que le microtensiomètre passe sous la lentille d’un microscope confocal à grande vitesse permettant de suivre quantitativement les espèces chimiques marquées par fluorescence avec une résolution latérale submicronique.

Introduction

Les interfaces air-eau recouvertes de films tensioactifs sont omniprésentes dans la vie quotidienne. Les injections d’eau tensioactive sont utilisées pour améliorer la récupération du pétrole des champs épuisés et sont utilisées comme solutions de fracturation hydraulique pour le gaz et le pétrole de schiste. Les mousses gaz-liquides et les émulsions liquide-liquide sont communes à de nombreux procédés industriels et scientifiques en tant que lubrifiants et agents de nettoyage et sont courantes dans les aliments. Les tensioactifs et les protéines aux interfaces stabilisent les conformations d’anticorps pendant l’emballage, le stockage et ^{l’administration 1,2,3,4,5}, la stabilité du film lacrymal dans ^{l’œil 6,7,8} et la mécanique pulmonaire ^{9,10,11,12,13,14}, ¹⁵.

L’étude des agents tensioactifs ou des tensioactifs adsorbant les interfaces et de leurs propriétés a une longue histoire avec de nombreuses techniques expérimentales différentes ^{16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27} . Un développement récent est le microtensiomètre à pression capillaire (CPM), qui permet l’examen des propriétés interfaciales sur des interfaces très incurvées, à des échelles de longueur beaucoup plus petites, tout en utilisant beaucoup moins de matériaux que d’autres méthodes courantes 9,23,24,25. La microscopie confocale à fluorescence (CFM) peut être utilisée pour étudier la morphologie des lipides et des protéines aux interfaces air-eau dans le CPM²² ou sur les creux de Langmuir 20,26,27,28,29. Ici, un CPM et un CFM ont été combinés pour relier les phénomènes morphologiques aux propriétés interfaciales dynamiques et d’équilibre afin de développer des relations structure-fonction pour les interfaces biologiques et technologiques.

Il existe de nombreux paramètres importants dans les systèmes de tensioactifs interfaciaux accessibles au CPM-CFM. Dans le CPM, une bulle d’air de 30 à 200 μm de diamètre est épinglée à l’extrémité d’un tube capillaire en verre. Dans les versions antérieures du CPM, la différence de pression capillaire entre l’intérieur et l’extérieur de la bulle était contrôlée via une colonne d’eau et une pompe à seringue oscillatoire ^9,30 ; la nouvelle version décrite ici les remplace par une pompe microfluidique de plus grande précision, contrôlée par ordinateur. La tension superficielle (γ) est déterminée par l’équation de Laplace, ΔP = 2γ/R, à partir de la chute de charge à travers l’interface définie par la pompe, ΔP, et l’analyse optique du rayon de courbure de la bulle, R. La tension superficielle dynamique de l’interface peut être déterminée avec une résolution temporelle de 10 ms suite à la génération d’une nouvelle bulle en contact avec un liquide en vrac contenant un tensioactif soluble. La dynamique d’adsorption du tensioactif peut être décrite par l’équation classique^de Ward-Tordai ^10,31 pour déterminer les propriétés essentielles du tensioactif, y compris la diffusivité, la couverture de surface et la relation entre la concentration en vrac et la tension superficielle d’équilibre. Une fois qu’une tension superficielle d’équilibre est atteinte, la zone interfaciale peut être oscillée pour mesurer le module dilatationnel, en enregistrant les changements de tension superficielle induits par de petits changements dans la surface de la bulle, A³². Pour les interfaces plus complexes qui développent leurs propres structures internes telles que des polymères ou des protéines intriqués, la tension superficielle, , est remplacée par une contrainte de surface plus générale ^4,33, .

La stabilité pulmonaire pendant la respiration peut être directement liée au maintien d’une faible tension superficielle et d’un module dilatationnel élevé à l’interface air-liquide alvéolaire ^9,10. Toutes les surfaces pulmonaires internes sont tapissées d’un film continu de liquide de la muqueuse épithéliale d’épaisseur pour maintenir l’hydratation des tissus³⁴. Ce liquide de la muqueuse épithéliale est principalement de l’eau, avec des sels et diverses autres protéines, enzymes, sucres et tensioactifs pulmonaires. Comme c’est le cas pour toute interface liquide-vapeur incurvée, une pression capillaire est induite avec la pression plus élevée à l’intérieur de l’alvéole (ou bulle). Cependant, si la tension superficielle était constante partout dans les poumons, l’équation de Laplace, ΔP = 2γ/R, montre que les alvéoles plus petites auraient une pression interne plus élevée par rapport aux alvéoles plus grandes, forçant les teneurs en gaz des alvéoles plus petites à s’écouler vers des alvéoles plus grandes et plus basses. C’est ce qu’on appelle « l’instabilité de Laplace ^»9,35. Le résultat net est que les plus petites alvéoles s’effondreraient et seraient remplies de liquide et deviendraient difficiles à regonfler, provoquant l’effondrement d’une partie du poumon, et d’autres parties se gonfleraient à l’excès, deux symptômes typiques du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Cependant, dans un poumon qui fonctionne correctement, la tension superficielle change dynamiquement à mesure que l’interface air-liquide épithélial dans la zone interfaciale alvéole se dilate et se contracte pendant la respiration. Si , ou , la pression de Laplace diminue avec un rayon décroissant et augmente avec un rayon croissant de manière à éliminer l’instabilité de Laplace, stabilisant ainsi le poumon⁹. Par conséquent, , et comment cela dépend de la fréquence, de la morphologie et de la composition de la monocouche, et de la composition du liquide alvéolaire peut être essentiel pour la stabilité pulmonaire. Le CPM-CFM a également fourni les premières démonstrations des effets de la courbure interfaciale sur l’adsorption du tensioactif²⁵, la morphologie monocouche²² et le module dilatationnel⁹. Le petit volume (~1 mL) du réservoir dans le CPM permet l’introduction, l’élimination ou l’échange rapide de la phase liquide et minimise la quantité requise de protéines ou de tensioactifs coûteux¹⁰.

Le contraste dans une image CPM-CFM est dû à la distribution de petites fractions de lipides ou de protéines marqués par fluorescence à l’interface^16,27. Les monocouches de tensioactifs bidimensionnels présentent souvent une séparation de phase latérale en fonction de la tension superficielle ou de la pression superficielle, π est la différence entre la tension superficielle d’une interface fluide-fluide propre, γ ₀, et une interface recouverte de tensioactif, γ. π peut être considérée comme la « pression » 2D causée par les interactions des molécules de tensioactif à l’interface qui agit pour abaisser la tension superficielle du fluide pur. À basse pression de surface, les monocouches lipidiques sont dans un état désorganisé semblable à un liquide; c’est ce qu’on appelle la phase d’expansion liquide (LE). Au fur et à mesure que la pression de surface augmente et que la surface par molécule lipidique diminue, les lipides s’orientent les uns avec les autres et peuvent subir une transition de phase de premier ordre vers la phase^condensée liquide ordonnée (LC) à longue distance ^16,20,27. Les phases LE et LC peuvent coexister à différentes pressions de surface et peuvent être visualisées comme des lipides marqués par fluorescence sont exclus de la phase LC et se séparent de la phase LE. Ainsi, la phase LE est lumineuse et la phase LC est sombre lorsqu’elle est imagée avec CFM¹⁶.

Le but de ce manuscrit est de décrire les étapes nécessaires à la construction et à l’exploitation du microtensiomètre combiné du microscope confocal. Cela permettra au lecteur d’effectuer des études d’adsorption, de mesurer la tension superficielle, le comportement rhéologique et d’examiner simultanément la morphologie interfaciale sur une interface air/eau ou huile/eau à l’échelle du micron. Cela comprend une discussion sur la façon de tirer, couper et hydrophober les capillaires requis, des instructions pour l’utilisation des modes de contrôle de la pression, de la courbure et de la surface, et le transfert interfacial de tensioactif insoluble à l’interface incurvée du microtensiomètre.

Protocol

1. Préparation des tubes capillaires Placez le capillaire dans un extracteur capillaire et exécutez le programme de traction souhaité pour fabriquer deux capillaires coniques d’un diamètre extérieur (OD) d’environ 1 μm à la pointe.REMARQUE: L’OD du capillaire avant de tirer doit être le OD spécifié pour s’adapter au support capillaire dans la cellule du microtensiomètre. Le diamètre intérieur (ID) du capillaire peut varier, mais affectera le rayon critique du capillaire…

Representative Results

Une source majeure d’erreur de mesure provient des capillaires qui présentent des défauts provenant soit du processus de coupe (Figure 5A, B), soit du processus de revêtement (Figure 5D). Les deux types de défauts entraînent des erreurs dans la détermination de la forme et de la taille de la bulle par le système d’analyse d’image optique, ce qui conduit à des valeurs de tension superficielle inexactes. Il est important d’examiner…

Discussion

Le CPM/CFM combiné est un outil puissant pour examiner la dynamique interfaciale, les équilibres et la morphologie. Ce protocole décrit les étapes nécessaires à l’obtention de données avec CPM/CFM.

La figure 2 montre la conception de la cellule avec les canaux pour le capillaire, le solvant et l’échange de chaleur indiqués. L’entrée pour l’échange de solvant doit être au bas de la cellule tandis que la sortie doit être en haut, ce qui permet ?…

Materials

1.5 O.D. Tygon tubing	Fischer Scientific		Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope	Nikon		Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution			Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix	Alconox	2510	Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter	Sutter Instruments
Chloroform	Sigma-Aldrich	650471	HPLC Plus
Curosurf	Chiesi		Lung Surfactant
Di Water			18.5 MΩ – cm
Ethanol	any		200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator	Dolan-Jenner Industries Inc.	281900100	Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module	Fluigent	LU-FEZ-0069	Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs	Fluigent		Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets			Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter	Norgren	F07-100-A3TG	Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator	Norgren	10R0400R	Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary	Sutter Instruments	B150-86-10	Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide	any		75 mm x 25 mm
Glass Syringe	Hamilton	84878	25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent	Sigma-Aldrich	667420	1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant	Avanti	850355C-200mg	16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software	National Instruments		2017
Longpass Filter	ThorLabs	FEL0650	650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC	Avanti	855675P	16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head	Masterflex	HV-77916-20	Peristaltic Pump
MATLAB	Mathworks		R2019
Micropipette Puller P-1000	Sutter Instruments		Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder			Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective	Nikon		Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module	National Instruments		Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings	IDEX	F-120x	10-32 Coned Ports
PEEK plug	IDEX	P-551	10-31 Coned Ports
pippette tips	Eppendorf	22492225	100 μL – 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps	Thermo Scientific	6320-0010
Plastic Syringe	Fischer Scientific	14-955-459	10 mL
Plumbing parts	Fischer Scientific		3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL	Eppendorf	3123000063	Micro pipetter
Sulfuric Acid	any		Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm	Nikon		Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt	Thermo Fischer Scientific	1395MP	Fluorophore
Vaccum Pump	Gast	DOA-P704-AA