כתב יד זה מתאר את התכנון וההפעלה של מיקרוטנציומטר/מיקרוסקופ קונפוקלי לביצוע מדידות בו-זמניות של מתח בין-פאזי וריאולוגיה של הרחבת פני השטח תוך הדמיית המורפולוגיה הבין-פאזית. זה מספק את הבנייה בזמן אמת של יחסי מבנה-תכונה של ממשקים חשובים בטכנולוגיה ובפיזיולוגיה.
ספיחה של מולקולות פעילות על פני השטח לממשקי נוזל-נוזל נמצאת בכל מקום בטבע. אפיון ממשקים אלה דורש מדידת שיעורי ספיגה של חומרים פעילי שטח, הערכת מתחי פנים של שיווי משקל כפונקציה של ריכוז פעילי שטח בתפזורת, והתייחסות לאופן שבו מתח הפנים משתנה עם שינויים באזור הבין-חלקיקי לאחר שיווי המשקל. הדמיה סימולטנית של הממשק באמצעות הדמיה פלואורסצנטית עם מיקרוסקופ קונפוקלי במהירות גבוהה מאפשרת הערכה ישירה של יחסי מבנה-תפקוד. במיקרוטנסיומטר הלחץ הנימי (CPM), בועת אוויר המיספרית מוצמדת בקצה הנימים במאגר נוזלי בנפח 1 מ”ל. הלחץ הנימי על פני ממשק הבועה נשלט באמצעות בקר זרימה מיקרופלואידי מסחרי המאפשר לחץ מבוסס מודל, עקמומיות בועות או שליטה בשטח הבועה בהתבסס על משוואת לפלס. בהשוואה לטכניקות קודמות כגון שוקת Langmuir וירידת התליון, דיוק המדידה והבקרה וזמן התגובה משופרים מאוד; ניתן ליישם וריאציות לחץ נימיות ולשלוט בהן באלפיות השנייה. התגובה הדינמית של ממשק הבועה מוצגת באמצעות עדשה אופטית שנייה כאשר הבועה מתרחבת ומתכווצת. קו המתאר של הבועה מתאים לפרופיל מעגלי כדי לקבוע את רדיוס עקמומיות הבועה, R, וכן את כל הסטיות מהמעגליות שיבטלו את התוצאות. משוואת לפלס משמשת לקביעת מתח הפנים הדינמי של הממשק. לאחר שיווי המשקל, תנודות לחץ קטנות יכולות להיות מוטלות על ידי המשאבה המיקרופלואידית הנשלטת על ידי מחשב כדי לתנוד את רדיוס הבועה (תדרים של 0.001-100 מחזורים לדקה) כדי לקבוע את המודולוס המתרחב הממדים הכוללים של המערכת קטנים מספיק כדי שהמיקרוטנציומטר יתאים מתחת לעדשה של מיקרוסקופ קונפוקלי במהירות גבוהה המאפשר מעקב אחר מינים כימיים המתויגים באופן פלואורסצנטי באופן כמותי ברזולוציה צידית תת-מיקרונית.
ממשקי אוויר-מים המכוסים על ידי סרטים פעילי שטח נמצאים בכל מקום בחיי היומיום. הזרקות מים פעילי שטח משמשות לשיפור התאוששות הנפט משדות מדולדלים ומשמשות כפתרונות שבירת הידראוליים לגז פצלי שמן ונפט. קצף גז-נוזלי ותחליב נוזלי-נוזלי נפוצים בתהליכים תעשייתיים ומדעיים רבים כחומרי סיכה וחומרי ניקוי והם נפוצים במזון. חומרים פעילי שטח וחלבונים בממשקים מייצבים את הקונפורמציות של נוגדנים במהלךהאריזה, האחסון והניהול 1,2,3,4,5, יציבות סרט הדמעות בעין 6,7,8, ומכניקה ריאתית 9,10,11,12,13,14, 15.
לחקר חומרים פעילים על פני השטח או חומרים פעילי שטח הסופחים לממשקים ולתכונותיהם יש היסטוריה ארוכה עם טכניקות ניסיוניות רבות ושונות 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . התפתחות אחרונה היא מיקרוטנסומטר לחץ נימי (CPM), המאפשר בחינה של תכונות בין-פרצופיות בממשקים מעוקלים מאוד, בסקאלות אורך קטנות בהרבה, תוך שימוש בחומרים נמוכים משמעותית משיטות נפוצות אחרות 9,23,24,25. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית (CFM) יכולה לשמש לחקר המורפולוגיה של שומנים וחלבונים בממשקי האוויר-מים ב-CPM22 או ב-Langmuir troughs 20,26,27,28,29. כאן שולבו CPM ו- CFM כדי לחבר תופעות מורפולוגיות לתכונות בין-תחומיות דינמיות ושיווי משקל כדי לפתח יחסי מבנה-פונקציה עבור ממשקים ביולוגיים וטכנולוגיים.
ישנם פרמטרים רבים בעלי חשיבות במערכות פעילי שטח בין-תחומיים הנגישות ל- CPM-CFM. ב- CPM, בועת אוויר בקוטר 30-200 מיקרומטר מוצמדת לקצה צינור נימי זכוכית. בגרסאות מוקדמות יותר של ה-CPM, הפרש הלחץ הנימי בין החלק הפנימי והחיצוני של הבועה נשלט באמצעות עמוד מים ומשאבת מזרק מתנד 9,30 ; הגרסה החדשה המתוארת כאן מחליפה אותם במשאבה מיקרופלואידית מדויקת יותר, הנשלטת על ידי מחשב. מתח הפנים (γ) נקבע באמצעות משוואת לפלס, ΔP = 2γ/R, מירידת הלחץ על פני הממשק שנקבע על ידי המשאבה, ΔP, וניתוח אופטי של רדיוס העקמומיות של הבועה, R. ניתן לקבוע את מתח הפנים הדינמי של הממשק ברזולוציית זמן של 10 אלפיות השנייה לאחר יצירת בועה חדשה במגע עם נוזל בתפזורת המכיל חומר פעילי שטח מסיס. ניתן לתאר את דינמיקת הספיחה של פעילי השטח על ידי משוואת וורד-טורדאי הקלאסית10,31 כדי לקבוע תכונות חיוניות של חומר פעילי השטח, כולל הדפיזור, כיסוי פני השטח והקשר בין ריכוז בתפזורת למתח פני השטח של שיווי המשקל. ברגע שמושג מתח פנים של שיווי משקל, ניתן לתנוד את האזור הבין-צדדי כדי למדוד את המודולוס המתרחב, על ידי רישום השינויים במתח הפנים, המושרים על ידי שינויים קטנים בשטח הפנים של הבועה, A32. עבור ממשקים מורכבים יותר המפתחים מבנים פנימיים משלהם כגון פולימרים או חלבונים סבוכים, מתח הפנים, , מוחלף על ידי מתח פני השטח הכללי יותר 4,33,
.
יציבות הריאות במהלך הנשימה עשויה להיות קשורה ישירות לשמירה הן על מתח פנים נמוך והן על מודולוס מתרחב גבוה בממשק האוויר-נוזל הנאדי 9,10. כל משטחי הריאה הפנימיים מרופדים בסרט רציף בעובי מיקרון של נוזל רירית אפיתל כדי לשמור על הידרציה של הרקמות34. נוזל רירית אפיתל זה הוא בעיקר מים, עם מלחים וחלבונים שונים אחרים, אנזימים, סוכרים וחומרים פעילי שטח של הריאות. כמו בכל ממשק מעוקל של אדי נוזל, לחץ נימי מושרה עם הלחץ הגבוה יותר בחלק הפנימי של הנאדיות (או הבועה). עם זאת, אם מתח הפנים היה קבוע בכל מקום בתוך הריאות, משוואת לפלס, ΔP = 2γ/R, מראה כי נאדיות קטנות יותר היו בעלות לחץ פנימי גבוה יותר ביחס לנאדיות גדולות יותר, מה שמאלץ את תכולת הגז של הנאדיות הקטנות יותר לזרום לנאדיות גדולות יותר בלחץ נמוך יותר. זה ידוע בשם “חוסר יציבות לפלס”9,35. התוצאה נטו היא שהנאדיות הקטנות ביותר יתמוטטו ויתמלאו בנוזל ויתקשו לנפח אותן מחדש ולגרום לחלק מהריאה להתמוטט, וחלקים אחרים יתנפחו יתר על המידה, שניהם תסמינים אופייניים לתסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS). עם זאת, בריאה המתפקדת כראוי, מתח הפנים משתנה באופן דינמי כאשר ממשק נוזל האוויר-אפיתל באזור הבין-פאזי של הנאדיות מתרחב ומתכווץ במהלך הנשימה. אם , או
, לחץ לפלס יורד עם ירידה ברדיוס ועולה עם הגדלת הרדיוס כדי לחסל את חוסר היציבות של לפלס, ובכך לייצב את הריאה9. לפיכך,
, וכיצד זה תלוי בתדירות, מורפולוגיה והרכב חד שכבתי יותר, והרכב נוזל נאדי עשוי להיות חיוני ליציבות הריאות. ה- CPM-CFM סיפק גם את ההדגמות הראשונות של ההשפעות של עקמומיות בין-אישית עלספיחה פעילי שטח 25, מורפולוגיה חד-שכבתית22 ומודולוס9 מרחיב. הנפח הקטן (כ-1 מ”ל) של המאגר ב-CPM מאפשר הקדמה, הסרה או החלפה מהירה של השלב הנוזלי וממזער את הכמות הנדרשת של חלבונים יקרים או חומרים פעילי שטח10.
הניגודיות בתמונת CPM-CFM נובעת מהתפלגות של שברים קטנים של שומנים או חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי בממשק16,27. מונו-שכבות דו-ממדיות של פעילי שטח מפגינות לעתים קרובות הפרדת פאזה רוחבית כפונקציה של מתח פני השטח או לחץ פני השטח, π הוא ההבדל בין מתח הפנים של ממשק נוזל-נוזל נקי, γ0, לבין ממשק מכוסה פעילי שטח, γ. ניתן לחשוב על π כ”לחץ ” הדו-ממדי הנגרם על ידי אינטראקציות של מולקולות פעילי שטח בממשק הפועל להורדת מתח פני השטח הנוזלי הטהור. בלחצים נמוכים על פני השטח, חד-שכבתיים של שומנים נמצאים במצב לא מאורגן דמוי נוזל; זה ידוע כשלב הנוזל המורחב (LE). ככל שהלחץ על פני השטח עולה והשטח למולקולת השומנים פוחת, השומנים מכוונים זה עם זה ויכולים לעבור מעבר פאזה מסדר ראשון לשלב 16,20,27 של נוזל מסודר לטווח ארוך (LC) שלב 16,20,27. שלבי LE ו- LC יכולים להתקיים יחד בלחצים שונים על פני השטח וניתן לדמיין אותם כאשר שומנים המתויגים באופן פלואורסצנטי אינם נכללים בשלב ה- LC ומופרדים לשלב LE. לפיכך, שלב LE בהיר ופאזת ה- LC כהה כאשר היא מצולמת עם CFM16.
מטרתו של כתב יד זה היא לתאר את הצעדים הדרושים לבנייה ולתפעול של המיקרוטנסומטר המשולב של המיקרוסקופ הקונפוקלי. זה יאפשר לקורא לבצע מחקרי ספיחה, למדוד מתח פנים, התנהגות ריאולוגית, ולבחון מורפולוגיה בין-פאזית בו-זמנית בממשק אוויר/מים או שמן/מים בקנה מידה זעיר. זה כולל דיון כיצד למשוך, לחתוך ולהידריפוביזציה של הנימים הנדרשים, הוראות לשימוש במצבי לחץ, עקמומיות ובקרת שטח פנים, והעברה בין-אישית של חומר פעילי שטח בלתי מסיסים לממשק המעוקל של מיקרוטנציומטר.
ה-CPM/CFM המשולב הוא כלי רב עוצמה לבחינת דינמיקה בין-פאזית, שיווי משקל ומורפולוגיה. פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים לקבלת נתונים באמצעות CPM/CFM.
איור 2 מראה את עיצוב התא עם תעלות עבור הנימים, הממסים וחילופי החום שצוינו. הכניסה להחלפת ממסים צריכה להיות בתחתית התא…
The authors have nothing to disclose.
כל תמונות המיקרוסקופיה הקונפוקלית התקבלו באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקלי הזקוף Nikon A1RHD Multiphoton. אנו מכירים בהדרכה ובסיוע של צוות התמיכה, במיוחד גיירמו מרקס, במרכז ההדמיה האוניברסיטאי באוניברסיטת מינסוטה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH HL51177. SI נתמך על ידי מענק הכשרה למחקר מוסדי של רות ל. קירששטיין NRSA F32 HL151128.
1.5 O.D. Tygon tubing | Fischer Scientific | Tubing | |
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope | Nikon | Confocal Microscope | |
Acid Cleaning Solution | Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting | ||
Alnochromix | Alconox | 2510 | Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution |
Ceramic glass cutter | Sutter Instruments | ||
Chloroform | Sigma-Aldrich | 650471 | HPLC Plus |
Curosurf | Chiesi | Lung Surfactant | |
Di Water | 18.5 MΩ – cm | ||
Ethanol | any | 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning | |
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator | Dolan-Jenner Industries Inc. | 281900100 | Light source; other light sources should work as well |
Flow EZ F69 mbar w/Link Module | Fluigent | LU-FEZ-0069 | Microfluidic Pump |
Fluigent SDK VIs | Fluigent | Required for CPM virtual Interface | |
Fluoroelastomer gaskets | Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3 | ||
Gas filter | Norgren | F07-100-A3TG | Put between microfluidic pump and pressure regulator |
Gas regulator | Norgren | 10R0400R | Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi |
Glass Capilary | Sutter Instruments | B150-86-10 | Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm |
Glass Slide | any | 75 mm x 25 mm | |
Glass Syringe | Hamilton | 84878 | 25 μL glass syringe |
Hydrophobizing Agent | Sigma-Aldrich | 667420 | 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted |
Insoluble surfactant | Avanti | 850355C-200mg | 16:0 DPPC in chloroform |
LabVIEW Software | National Instruments | 2017 | |
Longpass Filter | ThorLabs | FEL0650 | 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence |
Lyso-PC | Avanti | 855675P | 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine |
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/ Easy-Load II pump head | Masterflex | HV-77916-20 | Peristaltic Pump |
MATLAB | Mathworks | R2019 | |
Micropipette Puller P-1000 | Sutter Instruments | Capillary Puller | |
Microtensiometer Cell and Holder | Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4 | ||
Microtensiometer Objective | Nikon | Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm | |
NI Vision Development Module | National Instruments | Required for CPM virtual Interface | |
PEEK finger tight fittings | IDEX | F-120x | 10-32 Coned Ports |
PEEK plug | IDEX | P-551 | 10-31 Coned Ports |
pippette tips | Eppendorf | 22492225 | 100 μL – 1000 μL, Autoclaved |
Plastic Forceps | Thermo Scientific | 6320-0010 | |
Plastic Syringe | Fischer Scientific | 14-955-459 | 10 mL |
Plumbing parts | Fischer Scientific | 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing. | |
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL | Eppendorf | 3123000063 | Micro pipetter |
Sulfuric Acid | any | Used for acid cleaning solution | |
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm | Nikon | Confocal Microscope Objective | |
Texas Red DHPE triethylammonim salt | Thermo Fischer Scientific | 1395MP | Fluorophore |
Vaccum Pump | Gast | DOA-P704-AA |