動的界面の共焦点顕微鏡可視化のためのマイクロテンシオメータ
Summary
本稿では、界面形態を可視化しながら界面張力と表面拡張レオロジーを同時に測定するためのマイクロテンシオメータ/共焦点顕微鏡の設計と操作について述べる。これにより、技術や生理学において重要な界面の構造と特性の関係をリアルタイムに構築することができます。
Abstract
界面活性分子の流体-流体界面への吸着は、本質的に遍在している。これらの界面を特徴付けるには、界面活性剤吸着速度を測定し、バルク界面活性剤濃度の関数として平衡表面張力を評価し、平衡化後の界面領域の変化と表面張力がどのように変化するかを関連付ける必要があります。高速共焦点顕微鏡による蛍光イメージングによる界面の同時可視化により、構造機能関係を直接評価することができます。キャピラリー圧力マイクロテンシオメータ(CPM)では、半球状の気泡がキャピラリーの端部に固定され、1mL容の液体リザーバに固定される。気泡界面を横切る毛細管圧力は、ラプラス方程式に基づくモデルベースの圧力、気泡曲率、または気泡面積制御を可能にする市販のマイクロ流体フローコントローラ を介して 制御される。Langmuirトラフやペンダントドロップなどの以前の技術と比較して、測定と制御の精度と応答時間が大幅に向上しています。毛細管圧力の変化は、ミリ秒単位で適用および制御できます。気泡界面の動的応答は、気泡が膨張および収縮するにつれて、第2の光学レンズ を介して 視覚化される。気泡の輪郭は円形プロファイルにフィットし、気泡の曲率半径 R と、結果を無効にする円形度からの偏差を決定します。ラプラス方程式は、界面の動的表面張力を決定するために使用されます。平衡化に続いて、コンピュータ制御のマイクロ流体ポンプによって小さな圧力振動を課して気泡半径(0.001〜100サイクル/分の周波数)を振動させて拡張弾性率を決定することができ、システムの全体的な寸法は、マイクロテンシオメータが高速共焦点顕微鏡のレンズの下に収まるほど十分に小さく、蛍光タグ付き化学種をサブミクロンの横方向分解能で定量的に追跡することができる。
Introduction
界面活性剤膜で覆われた空気と水の界面は、日常生活の中で遍在しています。界面活性剤 – 水注入は、枯渇した油田からの油回収を強化するために使用され、シェールガスおよび油の水圧破砕ソリューションとして使用されます。気液フォームおよび液液エマルジョンは、潤滑剤および洗浄剤として多くの工業的および科学的プロセスに共通しており、食品において一般的である。界面における界面活性剤およびタンパク質は、包装、保存、および投与中に抗体立体配座を安定化させ1、2、3、4、5、眼における涙液膜安定性6、7、8、および肺力学9、10、11、12、13、14、15。
界面に吸着する界面活性剤または界面活性剤およびその特性の研究は、多くの異なる実験技術16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27.最近の開発は毛細血管圧力マイクロテンシオメータ(CPM)であり、これは他の一般的な方法よりも大幅に少ない材料を使用しながら、はるかに小さな長さスケールで高度に湾曲した界面上の界面特性の検査を可能にする9,23,24,25。共焦点蛍光顕微鏡(CFM)は、CPM 22またはラングミュアトラフ20、26、27、28、29の空気 – 水界面における脂質およびタンパク質の形態を研究するために使用することができる。ここでは、CPMとCFMを組み合わせて、形態学的現象を動的および平衡界面特性に結びつけ、生物学的および技術的インターフェースの構造機能関係を発展させています。
CPM-CFMがアクセス可能な界面界面活性剤系には、多数の重要なパラメータがあります。CPMでは、直径30〜200μmの気泡がガラスキャピラリーチューブの先端に固定されています。CPMの以前のバージョンでは、気泡の内側と外側の間の毛細管圧力差は、水柱および振動シリンジポンプを介して制御された9,30;ここで説明する新しいバージョンは、これらを高精度のコンピュータ制御マイクロ流体ポンプに置き換えます。表面張力(γ)は、ポンプによって設定された界面を横切る圧力損失ΔP、および気泡の曲率半径Rの光学分析から、ラプラス方程式ΔP = 2γ/Rを介して決定されます。界面の動的表面張力は、可溶性界面活性剤を含むバルク液体と接触する新しい気泡の発生に続く10msの時間分解能で決定することができる。界面活性剤吸着ダイナミクスは、拡散度、表面被覆率、およびバルク濃度と平衡表面張力の関係を含む界面活性剤の本質的な特性を決定するために、古典的なワードトルダイ式10、31によって記述することができる。平衡表面張力が達成されると、界面面積を振動させて拡張弾性率を測定することができ、、気泡表面積の小さな変化によって誘発される表面張力の変化を記録することによって、
A32。絡み合ったポリマーまたはタンパク質などの独自の内部構造を発達させるより複雑な界面の場合、表面張力は、、より一般的な表面応力4、33、
によって置き換えられる。
呼吸中の肺安定性は、肺胞空気液界面9、10における低い表面張力および高い拡張弾性率の両方を維持することに直接結びついていてもよい。すべての内部肺表面は、組織水和34を維持するために、上皮ライニング液の連続したミクロン厚の膜で裏打ちされている34。この上皮内層液は主に水であり、塩および様々な他のタンパク質、酵素、糖、および肺界面活性剤を含む。湾曲した液体 – 蒸気界面の場合と同様に、毛細管圧力は、肺胞(または気泡)の内側の圧力が高いほど誘導される。しかし、表面張力が肺内のあらゆる場所で一定であった場合、ラプラス方程式ΔP = 2γ/Rは、小さな肺胞は大きな肺胞と比較してより高い内圧を有し、小さな肺胞のガス含有量はより大きく、より低い圧力の肺胞に流れることを余儀なくされることを示している。これは「ラプラス不安定性」9,35として知られています。最終的な結果は、最小の肺胞が崩壊して液体で満たされ、再膨張が困難になり、肺の一部が崩壊し、他の部分が過剰に膨張し、どちらも急性呼吸窮迫症候群(ARDS)の典型的な症状である。しかし、適切に機能している肺では、呼吸中に肺胞界面領域の空気 – 上皮液界面が伸縮するにつれて、表面張力が動的に変化する。ラプラス圧力が半径の減少とともに減少し、半径の増加とともに増加してラプラスの不安定性を排除すると
、肺9が安定化する。
したがって、、それが周波数、単層形態および組成、
ならびに肺胞液組成にどのように依存するかは、肺安定性に不可欠であり得る。CPM-CFMはまた、界面活性剤吸着25、単層形態22および拡張弾性率9に対する界面曲率の影響の最初の実証を提供した。CPM内のリザーバの小容量(〜1mL)は、液相の迅速な導入、除去、または交換を可能にし、高価なタンパク質または界面活性剤10の必要量を最小限に抑える。
CPM−CFM画像におけるコントラストは、界面16、27における蛍光的にタグ付けされた脂質またはタンパク質の小さな画分の分布によるものである。二次元界面活性剤単層は、しばしば表面張力または表面圧力の関数として横方向の相分離を示すπ、 
γは、清浄な流体−流体界面の表面張力(γ0)と界面活性剤被覆界面との差π、純粋な流体表面張力を低下させるように作用する界面における界面活性剤分子の相互作用によって引き起こされる2−D「圧力」と考えることができる。低い表面圧力では、脂質単層は液体のような無秩序な状態にある。これは液体膨張(LE)相として知られています。面圧が上昇し、脂質分子当たりの面積が減少するにつれて、脂質は互いに配向し、長距離秩序液体凝縮(LC)相への一次相転移を受けることができる16、20、27。LE相およびLC相は、様々な表面圧力で共存することができ、蛍光的にタグ付けされた脂質がLC相から除外され、LE相に分離されるので視覚化することができる。したがって、CFM16で撮像すると、LE位相は明るく、LC位相は暗い。
この原稿の目的は、複合共焦点顕微鏡マイクロテンシオメータを構築して操作するために必要なステップを記述することです。これにより、読者は吸着研究を行い、表面張力、レオロジー挙動を測定し、ミクロンスケールの空気/水または油/水の界面で界面形態を同時に調べることができます。これには、必要な毛細血管を引っ張り、切断し、疎水化する方法、圧力、曲率、および表面積制御モードを使用するための指示、およびマイクロテンシオメータ湾曲界面への不溶性界面活性剤の界面移動に関する議論が含まれる。
Protocol
Representative Results
Discussion
結合されたCPM/CFMは、界面ダイナミクス、平衡、および形態を調べるための強力なツールです。このプロトコルでは、CPM/CFM を使用してデータを取得するために必要な手順について説明します。
図2 は、キャピラリー、溶媒、および熱交換用のチャネルが示されているセル設計を示しています。溶媒交換の入口はセルの下部にあり、出口は上部になけ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
全ての共焦点顕微鏡像は、ニコンA1RHDマルチフォトン直立共焦点顕微鏡を用いて得られた。我々は、ミネソタ大学のユニバーシティ・イメージング・センターにおけるサポート・スタッフ、特にギレルモ・マルケスの指導及び支援に感謝する。この研究はNIH Grant HL51177によって支援された。SIはルース・L・キルシュシュタインNRSA機関研究訓練助成金F32 HL151128の支援を受けた。
Materials
| 1.5 O.D. Tygon tubing | Fischer Scientific | Tubing | |
| A1RHD Multiphoton upright confocal microscope | Nikon | Confocal Microscope | |
| Acid Cleaning Solution | Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting | ||
| Alnochromix | Alconox | 2510 | Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution |
| Ceramic glass cutter | Sutter Instruments | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650471 | HPLC Plus |
| Curosurf | Chiesi | Lung Surfactant | |
| Di Water | 18.5 MΩ – cm | ||
| Ethanol | any | 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning | |
| Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator | Dolan-Jenner Industries Inc. | 281900100 | Light source; other light sources should work as well |
| Flow EZ F69 mbar w/Link Module | Fluigent | LU-FEZ-0069 | Microfluidic Pump |
| Fluigent SDK VIs | Fluigent | Required for CPM virtual Interface | |
| Fluoroelastomer gaskets | Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3 | ||
| Gas filter | Norgren | F07-100-A3TG | Put between microfluidic pump and pressure regulator |
| Gas regulator | Norgren | 10R0400R | Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi |
| Glass Capilary | Sutter Instruments | B150-86-10 | Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm |
| Glass Slide | any | 75 mm x 25 mm | |
| Glass Syringe | Hamilton | 84878 | 25 μL glass syringe |
| Hydrophobizing Agent | Sigma-Aldrich | 667420 | 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted |
| Insoluble surfactant | Avanti | 850355C-200mg | 16:0 DPPC in chloroform |
| LabVIEW Software | National Instruments | 2017 | |
| Longpass Filter | ThorLabs | FEL0650 | 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence |
| Lyso-PC | Avanti | 855675P | 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine |
| Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/ Easy-Load II pump head | Masterflex | HV-77916-20 | Peristaltic Pump |
| MATLAB | Mathworks | R2019 | |
| Micropipette Puller P-1000 | Sutter Instruments | Capillary Puller | |
| Microtensiometer Cell and Holder | Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4 | ||
| Microtensiometer Objective | Nikon | Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm | |
| NI Vision Development Module | National Instruments | Required for CPM virtual Interface | |
| PEEK finger tight fittings | IDEX | F-120x | 10-32 Coned Ports |
| PEEK plug | IDEX | P-551 | 10-31 Coned Ports |
| pippette tips | Eppendorf | 22492225 | 100 μL – 1000 μL, Autoclaved |
| Plastic Forceps | Thermo Scientific | 6320-0010 | |
| Plastic Syringe | Fischer Scientific | 14-955-459 | 10 mL |
| Plumbing parts | Fischer Scientific | 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing. | |
| Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL | Eppendorf | 3123000063 | Micro pipetter |
| Sulfuric Acid | any | Used for acid cleaning solution | |
| T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm | Nikon | Confocal Microscope Objective | |
| Texas Red DHPE triethylammonim salt | Thermo Fischer Scientific | 1395MP | Fluorophore |
| Vaccum Pump | Gast | DOA-P704-AA |
Referências
- Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Interfacial rheology of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface: Comparison of shear and dilatation deformation. Journal of Physical Chemistry B. 108 (12), 3835-3844 (2004).
- Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Shear and dilatational relaxation mechanisms of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface. Langmuir. 20 (23), 10159-10167 (2004).
- Kannan, A., Shieh, I. C., Fuller, G. G. Linking aggregation and interfacial properties in monoclonal antibody-surfactant formulations. Journal of Colloid and Interface Science. 550, 128-138 (2019).
- Kannan, A., Shieh, I. C., Leiske, D. L., Fuller, G. G. Monoclonal antibody interfaces: Dilatation mechanics and bubble coalescence. Langmuir. 34 (2), 630-638 (2018).
- Li, J. J., et al. Interfacial stress in the development of biologics: Fundamental understanding, current practice, and future perspective. The AAPS Journal. 21 (3), 44 (2019).
- Bhamla, M. S., Giacomin, C. E., Balemans, C., Fuller, G. G. Influence of interfacial rheology on drainage from curved surfaces. Soft Matter. 10 (36), 6917-6925 (2014).
- Fuller, G. G., Vermant, J. Complex fluid-fluid interfaces: Rheology and structure. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 3, 519-543 (2012).
- Rosenfeld, L., et al. Structural and rheological properties of meibomian lipid. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 2720-2732 (2013).
- Barman, S., Davidson, M. L., Walker, L. M., Anna, S. L., Zasadzinski, J. A. Inflammation product effects on dilatational mechanics can trigger the Laplace instability and acute respiratory distress syndrome. Soft Matter. 16 (29), 6890-6901 (2020).
- Barman, S., et al., Ramachadran, A., et al. . Recent Advances in Rheology: Theory, Biorheology, Suspension and Interfacial Rheology. , (2022).
- Alonso, C., Zasadzinski, J. A. A brief review of the relationship between monolayer viscosity, phase behavior, surface pressure and temperature using a simple monolayer viscometer. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (44), 22185-22191 (2006).
- Alonso, C., et al. More than a monolayer: Relating lung surfactant structure and mechanics to composition. Biophysical Journal. 87 (6), 4188-4202 (2004).
- Alonso, C., Bringezu, F., Brezesinski, G., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Modifying calf lung surfactant by hexadecanol. Langmuir. 21 (3), 1028-1035 (2005).
- Alonso, C., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: Protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophysical Journal. 89 (1), 266-273 (2005).
- Zasadzinski, J. A., et al. Inhibition of pulmonary surfactant adsorption by serum and the mechanisms of reversal by hydrophilic polymers: Theory. Biophysical Journal. 89 (3), 1621-1629 (2005).
- McConnell, H. M. Structures and transitions in lipid monolayers at the air-water-interface. Annual Reviews of Physical Chemistry. 42, 171-195 (1991).
- McConnell, H. M., Moy, V. T. Shapes of finite two-dimensional lipid domains. Journal of Physical Chemistry. 92 (15), 4520-4525 (1988).
- Zasadzinski, J. A., Stenger, P., Shieh, I., Dhar, P. Overcoming rapid inactivation of lung surfactant: analogies between competitive adsorption and colloid stability. Biochemica et Biophysica Acta. 1798 (4), 801-828 (2010).
- Zasadzinski, J. A., Nag, K., et al. . Surfactant Progress. , (2008).
- Valtierrez-Gaytan, C., et al. Spontaneous evolution of equilibrium morphology in phospholipid-cholesterol monolayers. Science Advances. 8 (14), (2022).
- Williams, I., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial rheology and direct imaging reveal domain-templated network formation in phospholipid monolayers penetrated by fibrinogen. Soft Matter. 15 (44), 9076-9084 (2019).
- Sachan, A. K., Zasadzinski, J. A. Interfacial curvature effects on the monolayer morphology and dynamics of a clinical lung surfactant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 134-143 (2018).
- Alvarez, N. J., Anna, S. L., Saigal, T., Tilton, R. D., Walker, L. M. Intefacial dynamics and rheology of polymer grafter nanoparticles at air-water and xylene-water interfaces. Langmuir. 28 (21), 8052-8063 (2012).
- Alvarez, N. J., Vogus, D. R., Walker, L. M., Anna, S. L. Using bulk convection in a microtensiometer to approach kinetic-limited surfactant dynamics at fluid-fluid interfaces. Journal of Colloid and Interface Science. 372 (1), 183-191 (2012).
- Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. Diffusion-limited adsorption to a spherical geometry: The impact of curvature and competitive time scales. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82, 011604 (2010).
- Shieh, I., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Visualizing the analogy between competitive adsorption and colloid stability to restore lung surfactant function. Biophysical Journal. 102 (4), 777-786 (2012).
- Shieh, I., Zasadzinski, J. A. Visualizing monolayers with a water-soluble fluorophore to quantify adsorption, desorption and the double-layer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 826-835 (2015).
- Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Takamoto, D. Y., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Coexistence of buckled and flat monolayers. Physical Review Letters. 81, 1650-1653 (1998).
- Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Fluorescence, polarized fluorescence, and Brewster angle microscopy of palmitic acid and lung surfactant protein B monolayers. Biophysical Journal. 72 (6), 2783-2804 (1997).
- Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. A microtensiometer to probe the effect of radius of curvature on surfactant transport to a spherical interface. Langmuir. 26 (16), 13310-13319 (2010).
- Ward, A. F. H., Tordai, L. Time dependents of boundary tensions of solutions. 1. The role of diffusion in time-effects. Journal of Chemical Physics. 14, 453-461 (1946).
- Lucassen, J., Vanden Tempel, M. Dynamic measurements of dilatational properties of a liquid interface. Chemical Engineering Science. 27 (6), 1283-1291 (1972).
- Lin, G. L., et al. Interfacial dilatational deformation accelerates particle formation in monoclonal antibody solutions. Soft Matter. 12 (14), 3293-3302 (2016).
- Bastacky, J., et al. Alveolar lining layer is thin and continuous: low temperature scanning electron microscopy of rat lung. Journal of Applied Physiology. 79 (5), 1615-1628 (1995).
- Adamson, A. W., Gast, A. P. . Physical Chemistry of Surfaces, Sixth ed. , 784 (1997).
- del Rio, O. I., Kwok, D. Y., Wu, R., Alvarez, J. M., Neumann, A. W. Contact angle measurements by axisymmetric drop shape analysis and an automated polynomial fit program. Colloids and Surfaces A Physicochemical and Engineering Aspects. 143 (2-3), 197-210 (1998).
- Kanthe, A., et al. No ordinary proteins: Adsorption and molecular orientation of monoclonal antibodies. Science Advances. 7 (5), 14 (2021).
- Manikantan, H., Squires, T. M. Surfactant dynamics: hidden variables controlling fluid flows. Journal of Fluid Mechanics. 892, 115 (2020).
- Narayan, S., et al. Dilatational rheology of water-in-diesel fuel interfaces: effect of surfactant concentration and bulk-to-interface exchange. Soft Matter. 17 (18), 4751-4765 (2021).
- Meng, G. N., Paulose, J., Nelson, D. R., Manoharan, V. N. Elastic instability of a crystal growing on a curved surface. Science. 343 (6171), 634-637 (2014).
- Kotula, A. P., Anna, S. L. Insoluble layer deposition and dilatational rheology at a microscale spherical cap interface. Soft Matter. 12 (33), 7038-7055 (2016).
- Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Phase and morphology changes in lipid monolayers induced by SP-B protein and its amino-terminal peptide. Science. 273 (5279), 1196-1199 (1996).
- Pocivavsek, L., et al. Stress and fold localization in thin elastic membranes. Science. 320 (5878), 912-916 (2008).
- Pocivavsek, L., et al. Lateral stress relaxation and collapse in lipid monolayers. Soft Matter. 4 (10), 2019-2029 (2008).
- Kim, K., Choi, S. Q., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Cholesterol nanodomains: their effect on monolayer morphology and dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 3054-3060 (2013).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Nonlinear chiral rheology of phospholipid monolayers. Soft Matter. 14 (13), 2476-2483 (2018).
- Kotula, A. P., Anna, S. L. Regular perturbation analysis of small amplitude oscillatory dilatation of an interface in a capillary pressure tensiometer. Journal of Rheology. 59, 85-117 (2015).
